一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术研发领域，涉及一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，若干份血浆混合后，依次经过混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品，用于其它后续研究步骤使用。样品IgG含量高，IgG谱广泛，亲水性与机体高亲和等，专供IVIg等血浆纯化蛋白制品的制品改良等研究需求使用。

【技术实现步骤摘要】
一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法。
技术介绍
静注人免疫球蛋白pH4(intravenousimmunoglobulins，IVIG)，是一种重要的人血浆蛋白制品，主要成分是免疫球蛋白IgG。IVIg作为传统的血液制品因其安全有效的特点而得到广泛应用，已经成为传统血液制品之一，其工业化程度很高。但也是受限于其高度的工业化，商业化IVIg制品的可编辑性极低。IVIg长久以来的多项缺陷与短板受工业化的限制而难以对制品采取基础研究所需的针对IVIg编辑优化的相关研究。如何尽可能保留血浆完整IgG抗体谱的前提下，不丢失IgG抗体的生物学活性并尽量降低纯化产物中杂蛋白的含量，是需要解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，纯化方法为在实验条件下对现有单一传统蛋白质纯化方法的集成应用，所制备样品IgG高纯高丰度，与IVIg制品高度相似；制备过程易干预，灵活度高，能够满足各种研究目的的实验样本需求，填补IVIg制品研发领域的空缺。解决以上技术问题的本专利技术中的一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：若干份血浆混合后，依次经过混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品，用于其它后续研究步骤使用。本专利技术中一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，包括以下具体步骤：步骤一：若干份血浆混合；步骤二：混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化：主要目的在于去除血浆白蛋白、脂质等非IgG成分。(1)步骤一混浆与饱和度100％的饱和硫酸铵溶液在常温条件下按体积比1：1等体积混合，静置后离心，弃上清取沉淀；需精确把控混合体积比，尽量去除上清液，这将影响白蛋白的去除效果以及IgG的沉淀效果，操作需尽量温和迅速，否则将影响IgG生物学活性。(2)沉淀按混浆与重溶粗蛋白体积比1：0.6-1于沉淀中加入适量平衡缓冲液(StartBuffer；SB)后震荡混匀充分溶解沉淀；(3)上述所得溶液经0.22μm孔径超滤膜超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；具体为使用0.22μm针头超滤膜(MerckmillporeLtd.Tullagreen,Carrigtwohill,Co.cork,IRL.)对重溶沉淀进行超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；步骤三：粗蛋白离子交换层析纯化：缓冲体系的pH、精氨酸浓度、盐浓度等因素将影响IgG整体纯度与回收率。(1)步骤二所得粗蛋白样品通过HitrapDesalting脱盐层析柱脱盐处理，监视器紫外峰完全通过后可重复上样；(2)除盐后样品通过HitrapCaptoMMC离子亲和层析柱结合粗蛋白IgG成分，使用洗脱缓冲液(ElutionBuffer；EB)洗脱与填料结合的IgG成分，收集洗脱峰组分(ET)，再生液(WashingBuffer；WB)完全通过后可重复上样；HitrapCaptoMMC阳离子交换层析柱的吸附纯化效果受到缓冲体系盐浓度、pH值以及温度等因素影响。实验过程处于恒温条件下，最大化提升IgG抗体的纯化效果，温度条件为25℃室温环境。(3)纯化蛋白样品保存于4℃条件或冰上备用；步骤四：纯化蛋白超滤及缓冲系置换：组分检测后使用离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度，即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品。具体为组分检测后使用Ultracel-30K离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度；即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品，可供后续实验需求使用。所述步骤(一)和步骤(二)之间还有若干份血浆混合预处理步骤和混浆去冷沉淀步骤。混浆去冷沉淀步骤主要目的在于去除血浆Ⅷ因子、纤维蛋白原vWF等非IgG成分。所述若干份血浆混合预处理步骤：获取原料血浆，根据研究需求可选用任意血浆份数，浆源类型，混浆比例，添加剂种类及数量条件制备混浆。进一步优化步骤中，所述原料血浆为若干份新鲜血浆或冻存期2年以内的冰冻血浆。所述混浆去冷沉淀步骤中去冷沉淀处理次数为1-2次，处理后混浆保存于4℃条件或冰上备用。混浆去冷沉淀操作为常规操作方式。所述步骤二的第(3)步中超滤为使用HitrapCaptoMMC阳离子交换层析柱5mL×5；所述平衡缓冲液(StartBuffer；SB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)，pH＝6.5，柱温25℃，流速为1.5mL/min。所述步骤三的洗脱缓冲液为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)含0.2-0.8M精氨酸，pH＝7.5-8.5。优化方案中，洗脱缓冲液为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)，含0.5M精氨酸，pH＝8.0。HitrapCaptoMMC阳离子交换层析柱对缓冲体系盐浓度敏感，降低盐浓度将有利于提升IgG纯化效果。也对缓冲体系亲疏水条件与有机试剂敏感，亲水性缓冲体系，不含有机试剂，提升IgG抗体的纯化效果。还对缓冲体系pH值敏感，本专利技术中IgG抗体的最适吸附环境为pH＝6.2-6.8，IgG抗体的最适洗脱环境为pH＝7.5-8.5，洗脱环境下，在pH变化＜1的前提下，升高pH有利于洗脱结合蛋白，提高总蛋白收率，但是将提升杂蛋白的比例，反之亦然。HitrapCaptoMMC阳离子交换层析柱对缓冲体系精氨酸浓度也敏感，本专利技术中IgG抗体的最适精氨酸洗脱浓度为0.2-0.8M精氨酸，洗脱环境下，在精氨酸浓度变化＜0.3M的前提下，升高精氨酸浓度有利于洗脱结合蛋白，提高总蛋白收率，但是将提升杂蛋白的比例，反之亦然。所述步骤(四)中模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG成品分装后于4℃(1周)、-20℃(1年)、-80℃(10年)条件下避光保存，避免反复冻融。所述纯化方法中组份检测为设有模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品检测步骤，即样品成品通过BCA、Elisa、WesternBlot、Coomassiebrilliantbluestaining生化实验检测分析其组分，是否含有硫酸铵、精氨酸、枸橼酸抗凝剂或其它成分，有各组份含量多少。所述纯化方法中组份检测为使用BCA蛋白浓度测定法测定步骤三所得纯化蛋白样品的总蛋白浓度或通过Elisa法测定IgG浓度。本专利技术混浆IgG样品具备传统市售IVIg制品的多人份混合IgG，样品IgG含量高，IgG谱广泛，亲水性与机体高亲和等特点。对传统的单一的蛋白纯化分离工艺与步骤进行了集成和优化，所需实验条件温和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：若干份血浆混合后，依次经过混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品，用于其它后续研究步骤使用。/n

【技术特征摘要】
1.一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：若干份血浆混合后，依次经过混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品，用于其它后续研究步骤使用。


2.根据权利要求1所述的一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：包括以下具体步骤：步骤一：若干份血浆混合；
步骤二：混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化：
(1)步骤一混浆与饱和度100％的饱和硫酸铵溶液在常温条件下按体积比1：1混合，静置后离心，弃上清取沉淀；
(2)沉淀中加入平衡缓冲液后震荡混匀充分溶解沉淀；平衡缓冲液体积与原混浆体积比为0.6-1：1；
(3)上述所得溶液经0.22μm孔径超滤膜超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；
步骤三：粗蛋白离子交换层析纯化：
(1)粗蛋白样品通过脱盐层析柱脱盐处理，监视器紫外峰完全通过后重复上样；
(2)除盐后样品通过离子亲和层析柱结合粗蛋白IgG成分，使用洗脱缓冲液洗脱与填料结合的IgG成分，收集洗脱峰组分(ET)，再生液完全通过后可重复上样；
(3)纯化蛋白样品保存于4℃条件或冰上备用；
步骤四：纯化蛋白超滤及缓冲系置换：组分检测后使用离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度，即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品。


3.根据权利要求1所述的一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(一)和步骤(二)之间还有若干份血浆混合预处理步骤和混浆去冷沉淀步骤。


4.根据权利要求3所述的一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：所述若干份血浆混合预处理步骤：获取原料血浆，根据研究需求选用任意血浆份...

【专利技术属性】
技术研发人员：马莉，徐继轩，张巍，杜晞，王宗奎，叶生亮，张容，王娅，李长清，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51