一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域公开了一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，该方法主要以鸡白痢沙门氏菌C79‑3作为攻毒菌株，选择11日龄SPF鸡胚为感染动物，通过蛋壳接触的方法进行攻毒。攻毒后孵化雏鸡表现出拉灰白稀粪，粪便黏连肛门，精神沉郁，羽毛逆立症状，剖检死亡雏鸡具有鸡白痢特征性病变，模型稳定可靠。该模型可为药物预防和治疗雏鸡鸡白痢的研究提供研究工具。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法
本专利技术属于生物
，涉及一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法。
技术介绍
鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的一种急性、全身性疾病，以经卵垂直传播和经消化道的水平传播为主，各年龄阶段的鸡均可感染，其中2-3周龄以内的雏鸡感染率和死亡率极高，雏鸡感染后主要表现为拉灰白色稀粪、精神沉郁、羽毛逆立、畏寒扎堆等症状；成年鸡通常呈隐形感染或慢性感染，通常不表现症状，但会导致产蛋量和孵化率下降，同时带菌母鸡可经卵垂直传播给鸡胚，经胚胎感染的雏鸡孵出后成为弱雏，大多在1-2日内死亡或成为带菌鸡通过粪便、饮水、饲料等水平传播方式感染鸡群，给我国养禽业带来巨大的经济损失。目前已知的鸡疾病模型的建立方法多以出壳的幼龄雏鸡或成年雏鸡作为实验动物，以口服滴喂或注射的途径攻毒，少有以鸡胚为试验动物进行鸡白痢沙门氏菌感染模型的建立，其中以蛋壳接触接种的方式进行鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立鲜有报道。而据临床实践研究显示垂直传播是鸡白痢沙门氏菌病重要的传播方式，带菌种鸡可将鸡白痢沙门氏菌垂直传播给种蛋，从而孵出的蛋菌雏鸡，其胎粪、绒毛、蛋壳中都含有大量的鸡白痢沙门氏菌，进而感染同群鸡群；而本鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立，通过蛋壳接触接种的方式可模拟带菌种鸡以及蛋壳污染的传播模式。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何建立鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型，为雏鸡鸡白痢的药物防治的研究提供基础。为达到上述目的，本专利技术所采用的的技术方案是：一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，选择鸡白痢沙门氏菌C79-3作为攻毒菌株，选择SPF鸡胚为攻毒动物，攻毒方法为蛋壳接触接种，攻毒后每日观察鸡胚死亡情况；待鸡胚孵出后，观察雏鸡的精神状态和粪便情况，对死亡雏鸡进行剖检，将死亡雏鸡脏器研磨液进行PCR扩增检测。一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的构建方法，选择鸡白痢沙门氏菌C79-3作为攻毒菌株，以SPF鸡胚为试验动物，通过蛋壳接触方式进行攻毒，孵出后雏鸡表现出持续拉灰白、黄白或白绿色稀粪，精神沉郁，食欲不振，糊肛症状，剖检死亡雏鸡有鸡白痢特征病变并且可分离到鸡白痢沙门氏菌，即可得到鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型。进一步的，所述SPF鸡胚为11日龄SPF鸡胚。进一步的，所述蛋壳接触接种方式为鸡胚于无菌蛋托中，完全浸泡在菌液中2min。进一步的，菌液浓度为9×105CFU/mL。进一步的，PCR检测的引物如下：上游引物：ipaJF:5’-TACCTGTCTGCTGCTCCG-3’下游引物：ipaJR:5’-ACCCTGCAAACCTGAAATC-3’。进一步的，攻毒方法为蛋壳接触接种：将从恒温孵育箱中取出的11日龄SPF鸡胚，于无菌蛋托中，完全浸泡于4℃菌液中2min，待自然干燥后，重新置于恒温孵育箱中孵育。进一步的，鸡白痢沙门氏菌C79-3菌液的制备方法为：取鸡白痢沙门氏菌C79-3于缓冲蛋白胨水增菌复苏，37℃震荡培养24h，后三区划线于无菌麦康凯琼脂平板，37℃，培养24h，挑取单个无色透明菌落接种于10mL无菌亚硒酸盐胱氨酸增菌液，37℃震荡培养24h后，取100μL菌液于10mLLB液体培养基，37℃震荡培养8h，通过梯度稀释，涂布于麦康凯琼脂平板计数，并用无菌PBS稀释菌液浓度至9×105CFU/mL。进一步的，所述11日龄SPF鸡胚的制备方法为：将1日龄SPF鸡胚置于恒温孵育箱中孵育，孵育温度为37℃，湿度为60％，孵育至11日龄。进一步的，所述死亡雏鸡脏器研磨液的制备方法为：将心、肝、肺、盲肠无菌采集放入无菌PBS液中研磨制成组织研磨液。进一步的，PCR扩增前，无菌取组织研磨液，均匀涂布于无菌麦康凯琼脂平板，37℃培养24h，挑取无色、透明、光滑的疑似鸡白痢沙门氏菌的单个菌落，接种于无菌亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，37℃振荡培养24h。进一步的，PCR扩增步骤为：将反应体系于PCR仪上扩增，反应总体系为10μL，其中ddH2O3.5μL，2×TaqMastermix5μL，特异性上下游引物混合液(10μM)1.0μL，待测模板1.0μL；反应条件为95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s(×30)；72℃5min延伸；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。进一步的，根据所述方法构建的鸡白痢鸡胚感染模型，可应用于鸡白痢沙门氏菌病的药物预防和治疗。生物保藏说明：鸡白痢沙门氏菌标准菌株C79-3，购自中国兽医药品监察所，保藏于兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC519。本专利技术的有益效果在于，利用鸡白痢标准菌株C79-3株，通过浸泡的蛋壳接种方式可以构建稳定且重复性好的鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型，该模型可为下一步进行雏鸡的鸡白痢沙门氏菌病的药物预防和治疗提供研究工具。在使用该模型进行药物相关研发试验时，可于雏鸡出壳后，针对发病的雏鸡进行中药或化学药物的临床药效试验，可根据药物本身的特性选择合适的给药方式。若试验药物为中药，则可主要以发病雏鸡的临床症状消失为观察指标，并以最终治愈率为80％以上为标准判定药物是否合格；若试验药物为化药，则可主要以发病雏鸡的临床症状消失以及体内病原菌的杀灭作用为观察指标，并以最终治愈率80％以上以及鸡白痢沙门氏菌阳性检出率为零作为标准判定药物是否合格。附图说明图1为出壳后攻毒组雏鸡的临床表现，其中a代表攻毒组雏鸡出现拉灰白色稀粪的临床表现；b代表攻毒组雏鸡出现精神沉郁、羽毛蓬乱的临床表现；c代表攻毒组雏鸡出现肛门处粘有灰白稀粪的临床表现。图2为出壳后攻毒组雏鸡各脏器的病理剖检变化，其中d代表攻毒组病死雏鸡肝脏土黄色、淤血的病理现象；e代表攻毒组病死雏鸡肺充血的病理现象；f代表攻毒组病死雏鸡盲肠膨大的病理现象；g代表攻毒组病死雏鸡卵黄吸收不良，含有黄绿色干酪样内容物的病理现象。图3为各组鸡白痢沙门氏菌PCR结果。其中M代表DL2000PlusDNAMaker，1、2、3、5、6、8、11代表攻毒组雏鸡样本，4、7、9、10代表空白组雏鸡样本。具体实施方式实施例1本专利技术公开了一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立，本领域的技术人员可以借鉴本文内容，适当修改工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的提换和改动对于本领域技术人员来说都是显而易见的，他们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述毒株和应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的毒株和应用进行改动，来实现和应用本专利技术技术。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及的饲养为本领域中常规饲养方法，在一般实验室环境中饲养，所述一般实验室环境为普通室内净化等级，常规育雏温度。饲料：常规无抗饲料。饮水：普通生活用水。实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，选择鸡白痢沙门氏菌C79-3作为攻毒菌株，选择SPF鸡胚为攻毒动物，攻毒方法为蛋壳接触接种，攻毒后每日观察鸡胚死亡情况；待鸡胚孵出后，观察雏鸡的精神状态和粪便情况，对死亡雏鸡进行剖检，将死亡雏鸡脏器研磨液进行PCR扩增检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，选择鸡白痢沙门氏菌C79-3作为攻毒菌株，选择SPF鸡胚为攻毒动物，攻毒方法为蛋壳接触接种，攻毒后每日观察鸡胚死亡情况；待鸡胚孵出后，观察雏鸡的精神状态和粪便情况，对死亡雏鸡进行剖检，将死亡雏鸡脏器研磨液进行PCR扩增检测。


2.根据权利要求1所述的一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，菌液浓度为9×105CFU/mL。


3.根据权利要求1所述的一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，PCR检测的引物如下：
上游引物：ipaJF:5’-TACCTGTCTGCTGCTCCG-3’
下游引物：ipaJR:5’-ACCCTGCAAACCTGAAATC-3’。


4.根据权利要求1所述的一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，攻毒的SPF鸡胚为11日龄。


5.根据权利要求1所述的一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，攻毒方法为蛋壳接触接种：将从恒温孵育箱中取出的11日龄SPF鸡胚，于无菌蛋托中，完全浸泡于4℃菌液中2min，待自然干燥后，重新置于恒温孵育箱中孵育。


6.根据权利要求1所述的一种鸡白痢沙门氏菌鸡胚感染模型的建立方法，其特征在于，鸡白痢沙门氏菌C79-3菌液的制备方法为：取鸡白痢沙门氏菌C79-3于缓冲蛋白胨水增菌复苏，37℃震荡培养24h，后三区划线于无菌麦康凯琼脂平板，37℃，培养24h，挑取单个无色透明菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：许小琴，严静，王银龙，张玥，王广泽，汪培嘉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32