酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法技术

本发明专利技术公开一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法，首先制备耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶，将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶与主要的淫羊藿黄酮苷（朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷）在含有有机溶剂的反应体系中进行酶反应，可有效减少中间产物，提高淫羊藿苷元转化得率至90%以上。反应后的耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶可以回收利用，降低了淫羊藿苷元的制备成本，具有操作简单、成本低、适合大批量生产等特点。特点。

【技术实现步骤摘要】
酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法


[0001]本专利技术涉及一种淫羊藿苷元的制备方法，尤其是一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法。

技术介绍

[0002]淫羊藿是常用的传统中药，其茎叶入药，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿、治疗阳痿遗精、风湿痛等药效。目前已发现的淫羊藿属中50余种淫羊藿，其中2015年版《中国药典》所收载的药用淫羊藿为：小蘖科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)；箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim)；柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim)；朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)和巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.Ying)等。淫羊藿药材（茎叶）中主要有效成分为淫羊藿黄酮苷，结构是如下：常见的淫羊藿黄酮苷，如下表所示。
[0003]但是，淫羊藿中药材中90%以上的淫羊藿黄酮苷为带2个糖基的淫羊藿苷和带3个糖基的朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等，人体不能直接吸收，生理活性低。口服后，淫羊藿苷和朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的糖基，在肠道消化系统酶和肠道微生物的作用下被降解为无糖基的淫羊藿苷元，吸收其药效。但人体消化系统的转化非常有限，导致大部分淫羊藿黄酮苷很难吸收。淫羊藿苷元吸收率高，具有良好的抗肿瘤、抗血栓、抗肝纤维化、抗骨质疏松、神经保护、改善前列腺功能、提高免疫、抗炎、抗氧化、抗皮肤老化等功能。
[0004]为了得到低糖基淫羊藿黄酮和苷元，中国专利技术专利号为ZL0313363.53，名称为“酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖基淫羊藿甙或甙元的方法”，公开了细菌、霉菌、酵母菌所产的酶逐步水解淫羊藿甙
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1（朝藿定A）或淫羊藿甙
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2（朝藿定B）或淫羊藿甙
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3（朝藿定C）糖基，变成淫羊藿甙
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7（箭藿苷A）或淫羊藿甙
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8（箭藿苷B）或淫羊藿甙
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9（箭藿苷C）；进一步水解成淫羊藿甙
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15（淫羊藿次苷II或宝藿苷I），最终变成淫羊藿苷元。细菌、霉菌、酵母菌所产的酶逐步水解淫羊藿苷（淫羊藿甙
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1）变成淫羊藿甙
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15（淫羊藿次苷II或宝藿苷I）或淫羊藿甙
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16（淫羊藿次苷I），最终变成淫羊藿苷元。但是此方法中间产物多，淫羊藿苷元收率很低，得率不到10%。
[0005]又有：李慧灵，陈宏基，林育成，叶德晓和周金林等，2020年发表了“生物酶法制备淫羊藿素工艺条件的研究”《生物化工》杂志，2020 年2月、第6卷（第1期），62
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64，68页。该文主要研究了β
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葡萄糖苷酶、酶解淫羊藿苷糖基转化为淫羊藿素（苷元）过程中，优化温度、pH、缓冲液倍数、底物与酶比以及酶解时间等5个因素，提高淫羊藿素（苷元）转化率方法。但是，文中并没有公开朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的酶转化，仅研究酶反应底物—淫羊藿苷，存在着反应浓度低、反应容器大，产业化成本高等缺点。
[0006]迄今为止，还没有关于利用耐有机溶剂的淫羊藿黄酮苷酶与淫羊藿黄酮苷（朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷）在加有有机溶剂的反应体系中反应，高效制备淫羊藿苷元的相关报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法。
[0008]本专利技术的技术解决方案是：一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法，其特征在于：制备耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶，将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶与淫羊藿黄酮苷在含有有机溶剂的反应体系中反应，制备淫羊藿苷元。
[0009]依次按照如下步骤制备：a．在培养基干物中添加质量比例为5～20%的淫羊藿或甘草茎叶或槐花为产酶诱导物，用液态发酵法或固态发酵法对曲霉菌或黑曲霉菌或酵母菌发酵5～8天，得到原酶液，所述原酶液是液态发酵法所得发酵液或固态发酵法所得培养基的浸提液；b．将原酶液经离心收集上清液，在上清液中加入3倍体积的甲醇或乙醇、过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将酶蛋白沉淀溶解于原酶液1/3～1/10体积的0.01～0.06M、pH 4～6的醋酸缓冲液或磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液中，离心除杂，得到耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液；c. 将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液与质量浓度为0.5%～14%的淫羊藿黄酮苷的甲醇或乙醇溶液混合，在温度30℃～60℃下反应6小时～36小时得反应液，所述淫羊藿黄酮苷为朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷中的至少一种，所述甲醇或乙醇的体积浓度为5%～40%；d. 将反应液离心收集沉淀A，将所收集的沉淀A水洗后溶解于四氢呋喃，过滤；向滤液中加入体积浓度为20%～55%的甲醇或乙醇溶液，离心收集沉淀B；用冰冷的体积浓度为20～55%的甲醇或乙醇溶液洗涤沉淀B，干燥得淫羊藿苷元。
[0010]所述d步骤离心收集沉淀B的同时收集上清液，并将上清液减压浓缩、干燥，得到淫羊藿苷元。
[0011]所述d步骤将反应液离心后分别收集沉淀A及上清液，向所收集的上清液中加入3倍体积的甲醇或乙醇，过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将所收集的酶蛋白沉淀溶解于步骤a所得原酶液70～90%体积的0.02M～0.04M的pH 4～6醋酸缓冲液或磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，离心除杂得到回收酶液。
[0012]本专利技术首先制备耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶，将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶与主要的淫羊藿黄酮苷（朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷）在含有有机溶剂的反应体系中进行酶反应，可有效减少中间产物，提高淫羊藿苷元转化得率至90%以上。耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶可以回收利用，降低了淫羊藿苷元的制备成本，具有操作简单、成本低、适合大批量生产等特点。
具体实施方式
[0013]本专利技术实施例采用的分析方法如下：一、高校液相色谱（HPLC）检测朝藿定A、B、C、淫羊藿苷：色谱仪，Waters 2695高效液相色谱分析仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站进行检测。色谱柱，中汇达Kromasil C18色谱柱（5μm,Φ4.6mm
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250mm）；流动相，乙腈（A）一水（B）：0～8 min，17～27 A；8～32 min，27 A 等梯度；32～60 min，27%～85％ A线性梯度；60～70 min，85 A等梯度；70～80 min，85％～90A；进样量，10L；柱温，35℃；流量，1.0mL／min；检测波长，273 nm。参比标准品朝藿定A、B、C或淫羊藿苷、待测样品各2 mg，分别加10 mL 50%乙醇，制成0．2 mg／mL的标准品溶液和待测样品。
[0014]二、高校液相色谱（HPLC）检测淫羊藿苷元：色谱仪，Waters 2695高效液相色谱分析仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站进行检测。色谱柱：中汇达Kromas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法，其特征在于：制备耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶，将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶与淫羊藿黄酮苷在含有有机溶剂的反应体系中反应，制备淫羊藿苷元。2.根据权利要求1所述酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法，其特征在于依次按照如下步骤制备：a．在培养基干物中添加质量比例为5～20%的淫羊藿或甘草茎叶或槐花为产酶诱导物，用液态发酵法或固态发酵法对曲霉菌或黑曲霉菌或酵母菌发酵5～8天，得到原酶液，所述原酶液是液态发酵法所得发酵液或固态发酵法所得培养基的浸提液；b．将原酶液经离心收集上清液，在上清液中加入3倍体积的甲醇或乙醇、过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将酶蛋白沉淀溶解于原酶液1/3～1/10体积的0.01～0.06M、pH 4～6的醋酸缓冲液或磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液中，离心除杂，得到耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液；c. 将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液与质量浓度为0.5%～14%的淫羊藿黄酮苷的甲醇或乙醇溶液混合，在温度30℃～60℃下反应6小...

【专利技术属性】
技术研发人员：金凤燮，鱼红闪，
申请(专利权)人：鱼红闪，
类型：发明
国别省市：