一种异齿裂腹鱼clock基因、克隆方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种异齿裂腹鱼clock基因、克隆方法及其应用。属于基因工程技术领域。包括异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA、编码的蛋白质和克隆方法和应用。本发明专利技术首次克隆了异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA，分析了组织表达特征，发现clock基因无论是对于雌性还是雄性异齿裂腹鱼，在肝脏、脾脏、心脏、脑、性腺和肌肉组织中都有表达，尤其在雌雄个体中，性腺中的表达量均显著高于其他组织，表明相对其他组织而言，clock基因在异齿裂腹鱼的繁殖过程中发挥着更大的作用，为从理论上揭示青藏高原裂腹鱼clock基因在季节性繁殖行为过程中的重要作用奠定基础，也为青藏高原裂腹鱼类资源养护提供了帮助。了帮助。了帮助。

【技术实现步骤摘要】
一种异齿裂腹鱼clock基因、克隆方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种异齿裂腹鱼clock基因、克隆方法及其应用。

技术介绍

[0002]异齿裂腹鱼属裂腹鱼亚科，广布于雅鲁藏布江，在中国脊椎动物红色名录中被评估为“无危种”，但其近缘物种如巨须裂腹鱼、拉萨裂腹鱼等被评估为“易危种”。异齿裂腹鱼集群产卵期为每年的3
‑
5月，表现出明显的季节性繁殖行为。
[0003]季节性繁殖周期包括性腺组织的年再生，主要由激素调节途径介导。越来越多的证据表明，节律性和繁殖行为是互相关联的，鱼类同其他脊椎动物一样，生殖腺的发育是周期性的，在指定的地区上，每年大概有规定的季节，这便是鱼类季节性的繁殖行为。
[0004]研究表明，在各种有机体中，一切生理和行为都是由生物钟控制的节律性活动，大脑以外广泛组织生物钟基因转录因子的发现，表明细胞节律性可能具有更广泛的生物学意义。异齿裂腹鱼在繁殖行为上表现出明显的节律性。
[0005]但是，这种鲜明的繁殖节律，却不清楚何种基因在其季节性繁殖中起到较为重要的作用。
[0006]因此，探明相应调节基因、及其组织表达模式，为青藏高原裂腹鱼类资源养护提供帮助是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种异齿裂腹鱼clock基因、克隆方法及其应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]本专利技术还提供了上述的异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术还提供了上述的异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA的克隆方法，包括3
’
RACE扩增和5
’
RACE扩增；
[0012]3’
RACE扩增以3
’
adaptor为反转录引物的cDNA为模板，用RC595
‑
F1和5.3
’
outer为引物进行第一轮PCR扩增，以得到的第一轮PCR扩增产物为模板，用RC595
‑
F2和5.3
’
inner为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；
[0013]将第二轮PCR扩增产物以特异性引物RC595
‑
RT1/RC595
‑
RT2扩增，得到cDNA，用RNase H和TdT处理；
[0014]5’
RACE扩增以经RNase H和TdT处理后的cDNA为模板，用5
’
adaptor和RC595
‑
R1为引物进行第一轮PCR扩增，以得到的第一轮PCR扩增产物为模板，用5.3
’
outer和RC595
‑
R2为引物进行第二轮PCR扩增；
[0015]将3
’
RACE扩增产物和5
’
RACE扩增产物拼接得到异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA；
[0016]3’
adaptor引物序列：5
’‑
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT
‑3’
，如SEQ ID NO：3所示；
[0017]RC595
‑
F1引物序列：5
’‑
AGTTCCTACAGGCCCCTCGGCTT
‑3’
，如SEQ ID NO：4所示；
[0018]5.3
’
outer引物序列：5
’‑
GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC
‑3’
，如SEQ ID NO：5所示；
[0019]RC595
‑
F2引物序列：5
’‑
CCAGCTGATCCTTCAGGCAGCGTT
‑3’
，如SEQ ID NO：6所示；
[0020]5.3
’
inner引物序列：5
’‑
GCTACGTAACGGCATGACAGTG
‑3’
，如SEQ ID NO：7所示；
[0021]RC595
‑
RT1引物序列：5
’‑
CTTAAAGTTTCCGATGAACTTGACATA
‑3’
，如SEQ ID NO：8所示；
[0022]RC595
‑
RT2引物序列：5
’‑
GGAGCATGTGGCAACAGAACT
‑3’
，如SEQ ID NO：9所示；
[0023]5’
adaptor引物序列：5
’‑
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGGGNNGGGNNGGGNNG
‑3’
，如SEQ ID NO：10所示；
[0024]其中，N为次黄嘌呤脱氧核苷酸；
[0025]RC595
‑
R1引物序列：5
’‑
GCAGCATGGTGCCCAGTTCCTTG
‑3’
，如SEQ ID NO：11所示；
[0026]RC595
‑
R2引物序列：5
’‑
TCGCCTCTTCTTCTCCGACTTGTTCCTA
‑3’
，如SEQ ID NO：12所示。
[0027]优选的：以3
’
adaptor为反转录引物的cDNA的合成方法：提取各样本总RNA，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，以3
’
adaptor为反转录引物合成cDNA。
[0028]优选的：3
’
RACE和5
’
RACE的第一轮PCR反应体系均为25μl，包括2X GC Buffer I 12.5μl、10μM上游引物0.5μl、10μM下游引物0.5μl、2.5mM dNTP 4μl、ddH2O 6.3μl、模板1μl和5U/μl Taq酶0.2μl；3
’
RACE和5
’
RACE的第二轮PCR反应体系均为50μl，包括2X GC Buffer I25μl、10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl、2.5mM dNTP 8μl、ddH2O 12.5μl、模板2μl和5U/μl Taq酶0.5μl。
[0029]优选的：3
’
RACE的反应程序为：95℃3min；94℃30s、58℃30s、72℃60s，33个循环；72℃7min；所述5
’...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.由权利要求1所述的异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述的异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，包括3
’
RACE扩增和5
’
RACE扩增；所述3
’
RACE扩增以3
’
adaptor为反转录引物的cDNA为模板，用RC595
‑
F1和5.3
’
outer为引物进行第一轮PCR扩增，以得到的第一轮PCR扩增产物为模板，用RC595
‑
F2和5.3
’
inner为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；将第二轮PCR扩增产物以特异性引物RC595
‑
RT1/RC595
‑
RT2扩增，得到cDNA，用RNase H和TdT处理；所述5
’
RACE扩增以经RNase H和TdT处理后的cDNA为模板，用5
’
adaptor和RC595
‑
R1为引物进行第一轮PCR扩增，以得到的第一轮PCR扩增产物为模板，用5.3
’
outer和RC595
‑
R2为引物进行第二轮PCR扩增；将3
’
RACE扩增产物和5
’
RACE扩增产物拼接得到异齿裂腹鱼clock基因全长cDNA；所述3
’
adaptor引物序列：5
’‑
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT
‑3’
，如SEQ ID NO：3所示；所述RC595
‑
F1引物序列：5
’‑
AGTTCCTACAGGCCCCTCGGCTT
‑3’
，如SEQ ID NO：4所示；所述5.3
’
outer引物序列：5
’‑
GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC
‑3’
，如SEQ ID NO：5所示；所述RC595
‑
F2引物序列：5
’‑
CCAGCTGATCCTTCAGGCAGCGTT
‑3’
，如SEQ ID NO：6所示；所述5.3
’
inner引物序列：5
’‑
GCTACGTAACGGCATGACAGTG
‑3’
，如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建设，王万良，张驰，曾本和，孙帅杰，
申请(专利权)人：西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：