一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，包括以下步骤：S1：Au NPs溶液的制备；S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备；备；S4：Au@MBN@Ag@Apt

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法


[0001]本专利技术涉及酶检测
，尤其是指一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法。

技术介绍

[0002]吲哚胺
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2，3
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二加氧酶(IDO)是色氨酸(Trp)代谢的限速酶。IDO被称为犬尿氨酸(Kyn)途径(KP)代谢的关键酶，它催化L
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Trp中吲哚环氧化的裂解，使其成为潜在的肿瘤免疫疗法药物靶标。通过自身免疫反应，IDO在维持外周免疫耐受和调节自身免疫反应中起着重要作用。与正常生理条件相比，在肿瘤微环境中容易发现IDO过度表达。IDO的过度表达会异常消耗Trp，并通过KP途径增加代谢产物的产生，这被认为是逃避潜在免疫反应的重要免疫效应途径。
[0003]临床研究表明，IDO在各种人类原位和转移性肿瘤组织(例如黑素瘤，卵巢癌，子宫癌，结直肠癌和神经胶质瘤)中异常表达，这与预后的影响呈负相关，导致IDO有助于建立病理性炎症状态以支持肿瘤生长和转移进程。其中，多种炎症因子(如，TNF
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α和IL
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1)影响IDO在肿瘤微环境中的表达和活性。因此开发一种快速、灵敏、可靠的检测IDO的方法迫在眉睫。
[0004]在癌症患者中，与IDO活性相关的Trp浓度和Kyn/Trp比率与存活率相关。目前检测上述指标的方法包括细胞免疫荧光技术、qRT
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PCR方法和Western Blot方法等。其中荧光方法由于其稳定性和高灵敏度而受到高度重视，但是这些荧光材料的合成过程复杂且耗时。而qRT
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PCR方法存在试剂盒昂贵、操作要求高等缺点。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，提高对吲哚胺2，3双加氧酶活性的检测灵敏度。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，包括以下步骤：
[0008]S1：Au NPs溶液的制备；
[0009]S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：
[0010]S21：将纯化后的Au NPs溶液与0.1mM的4
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巯基苯甲腈溶液以200：1～100：1(v/v)混合，孵化1h后，通过离心去除多余的4
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巯基苯甲腈，并重悬于蒸馏水中；
[0011]S22：1mM的AgNO3溶液和320uL 0.01M的抗坏血酸溶液以20：1～7：1(v/v)加入通过S21得到的溶液，搅拌30min，得到呈橘红色的Au@MBN@Ag NPs溶液；
[0012]S3：Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液的制备：
[0013]将纯化后的Au@MBN@Ag NPs与500nM的Apt以2：1(v/v)混合并在37℃下孵育12h，得到Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液；
[0014]S4：Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液的制备；
[0015]将0.5mM活化后的MB
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COOH与1mM色氨酸以1：2(v/v)混合并孵育1h后，得到复合物溶液A；
[0016]将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5％wt的牛血清白蛋白以10：1(v/v)混合并孵育1h，得到复合物溶液B；
[0017]对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B与Au@MBN@Ag@Apt NPs以1：2(v/v)混合并孵育10min～120min，得到Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液；
[0018]S5：IDO的检测：
[0019]将不同浓度的IDO分别加入对应的Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液中，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为785nm，通过拉曼光谱处理数据并对不同浓度的IDO定量分析。
[0020]本专利技术的有益效果在于：本专利技术以活化后的MB
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COOH、Trp和Au@MBN@Ag@Apt NPs构建检测IDO的三明治模型SERS传感器(即Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液)，其中Trp用于充当连接MB
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COOH(羧基磁珠)和Au@MBN@Ag@Apt的介质，使本专利技术中的检测方法对IDO的检测具有高灵敏度，并具有高度的抗干扰性和高度的特异性。因Trp中的氨基被MB
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COOH上的羧基捕获，当加入Au@MBN@Ag@Apt后，Apt与Trp相互识别并结合，即构成了Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB结构。当IDO加入Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB的三明治模型中时，由于IDO将Trp转化为Kyn，而Trp适配体只能识别Trp，故Au@MBN@Ag@Apt会与MB分离，导致MB上吸附的Au@MBN@Ag@Apt减少，从而导致内标信号的特征峰信号减弱。通过实验证明，基于本专利技术提供检测IDO浓度的方法大大降低了IDO的检测限，在实际应用中大大提高了检测灵敏度。由于Trp适配体与Trp侧链的良好结合和高度特异性，有且仅有Trp被Trp适配体特异性捕获，并且由于在于IDO对于Trp的催化作用具有专一性，使本专利技术中的检测方法具有高度的抗干扰性和高度的特异性，在对IDO检测的过程中对L
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半胱氨酸，L
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Kyn，赖氨酸，酪氨酸，组氨酸，L
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丝氨酸等氨基酸都无明显感应。
附图说明
[0021]图1为本专利技术中所构建的Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB三明治模型检测IDO时的流程图；
[0022]图2为本专利技术中不同体积的IDO加入Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB三明治模型后在2226cm
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1处的峰强度柱状图；
[0023]图3为本专利技术中IDO加入Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB三明治模型不同时间后在2226cm
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1处峰强度的折线图；
[0024]图4A为本专利技术实施例三中不同浓度IDO的SERS图谱；
[0025]图4B为本专利技术中IDO标准品浓度与特征峰(2226cm
‑1)的线性关系示意图；
[0026]图5为本专利技术中以不同氨基酸为介质时在2226cm
‑1处的峰强度柱状图。
具体实施方式
[0027]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：Au NPs溶液的制备；S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：S21：将纯化后的Au NPs溶液与0.1mM的4
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巯基苯甲腈溶液以200：1～100：1(v/v)混合，孵化1h后，通过离心去除多余的4
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巯基苯甲腈，并重悬于蒸馏水中；S22：1mM的AgNO3溶液和320uL 0.01M的抗坏血酸溶液以20：1～7：1(v/v)加入通过S21得到的溶液，搅拌30min，得到呈橘红色的Au@MBN@Ag NPs溶液；S3：Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液的制备：将纯化后的Au@MBN@Ag NPs与500nM的Apt以2：1(v/v)混合并在37℃下孵育12h，得到Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液；S4：Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液的制备；将0.5mM活化后的MB
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COOH与1mM色氨酸以1：2(v/v)混合并孵育1h后，得到复合物溶液A；将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5％wt的牛血清白蛋白以10：1(v/v)混合并孵育1h，得到复合物溶液B；对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B与Au@MBN@Ag@Apt NPs以1：2(v/v)混合并孵育10min～120min，得到Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液；S5：IDO的检测：将不同浓度的IDO分别加入对应的Au@MBN@Ag@Apt
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Trp
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MB复合物溶液中，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为785nm，通过拉曼光谱处理数据并对不同浓度的IDO定量分析。2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢玉栋，范敏，黄倩，游瑞云，沈慧英，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：