一种用于敲除猪UGT2C1基因的打靶载体制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于敲除猪UGT2C1基因的打靶载体制备方法及其应用，该方法包括以下步骤：(1)根据猪UGT2C1基因设计sgRNA向导序列；(2)将正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链DNA；将双链DNA与线性化的pGK1.1载体连接获得阳性打靶载体；(3)将阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC

【技术实现步骤摘要】
一种用于敲除猪UGT2C1基因的打靶载体制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及CRISPR/Cas9的应用技术，也涉及猪小肠上皮细胞系(IPEC
‑
J2)基因敲除模型的构建技术。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9为高效的核酸切割工具，基于CRISPR/Cas9的高效性的核酸切割能力与简便的操作，CRISPR技术已经广泛应用于猪、家兔、食蟹猴、大鼠、小鼠等基因的定点修饰，除此之外，CRISPR/Cas9系统也在许多植物基因组修饰研究中进行应用。CRISPR/Cas9作为新兴的基因组编辑技术，能够有效的研究动物生长和免疫系统相关基因，进一步对动物疾病治疗与完善基因生物学功能地研究有着重要的意义。
[0003]猪小肠上皮细胞系(IPEC
‑
J2)是良好的猪肠上皮模型细胞，与猪的原代小肠上皮细胞具有极强的相似性,是研究猪肠道疾病研究的理想体外模型。玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)作为一类发挥着雌激素效应的霉菌毒素,其对动物机体或人类健康造成严重的危害。近年来，已经发现暴露于特定的霉菌毒素会引起肠道功能改变及诱导人类慢性肠道炎症。本课题组前期对ZEA诱导的IPEC
‑
J2细胞进行转录组分析，发现UGT2C1基因表达水平显著下降，表明其可能参与ZEA诱导引起的细胞毒性调控。UGT2C1基因属于葡萄糖醛酸转移酶家族(UPT)，UPT为结合在内质网的膜蛋白，该酶能催化葡萄糖醛酸与大量外源性和内源性化学物质进行葡萄糖醛酸结合反应，是一种重要的解毒途径。建立猪UGT2C1基因的敲除载体及UGT2C1基因敲除的小肠上皮细胞模型，为深入研究UGT2C1基因功能及揭示ZEA致病机制提供了重要基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种可打靶猪UGT2C1基因的CRISPR/Cas9敲除载体及其应用于敲除猪小肠上皮细胞系(IPEC
‑
J2)中UGT2C1基因的构建方法。
[0005]本专利技术的方法可以通过以下技术方案实现：
[0006]一组基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪UGT2C1基因的sgRNA向导序列，该sgRNA向导序列包括sgRNA1和sgRNA2：
[0007]sgRNA1:CTTGGTGAAGGTACCAGGA(SEQ ID NO.1)；
[0008]sgRNA2:TCAGCCTTGATGCGCTGCT(SEQ ID NO.2)。
[0009]一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪UGT2C1基因的双链DNA，该双链DNA包括(1)～(2)组双链DNA：
[0010](1)sgRNA1F:5
’‑
CACCGCTTGGTGAAGGTACCAGGA
‑3’
(SEQ ID NO.3)，sgRNA1R:5
’‑
AAACTCCTGGTACCTTCACCAAGC
‑3’
(SEQ ID NO.4)；
[0011](2)sgRNA2F:5
’‑
CACCGTCAGCCTTGATGCGCTGCT
‑3’
(SEQ ID NO.5)，sgRNA2R:5
’‑
AAACAGCAGCGCATCAAGGCTGAC
‑3’
(SEQ ID NO.6)。
[0012]一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪UGT2C1基因的敲除载体，该载体采用以下
步骤构建：
[0013](1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪UGT2C1基因的转录本CDS序列设计如上述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5
’
端添加CACC，若sgRNA 5
’
端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5
’
端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
[0014](2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如上述的两组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物，对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，获得两种阳性打靶载体即为靶向敲除猪UGT2C1基因的敲除载体。
[0015]一种基于CRISPR/Cas9技术特异性靶向敲除猪UGT2C1基因的细胞系，该细胞系为将上述的两种阳性打靶载体混合电转入IPEC
‑
J2细胞并进行筛选和验证得到的。
[0016]一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪小肠上皮细胞系中UGT2C1基因的方法，该方法包括以下步骤：
[0017](1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪UGT2C1基因的转录本CDS序列设计如上述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5
’
端添加CACC，若sgRNA 5
’
端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5
’
端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
[0018](2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如上述的两组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物，对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，获得两种阳性打靶载体即为靶向敲除猪UGT2C1基因的敲除载体；
[0019](3)细胞转染：将两种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC
‑
J2并进行筛选验证和培养获得猪UGT2C1基因靶向敲除的IPEC
‑
J2细胞。
[0020]作为一种优选技术方案，上述方法的步骤(2)中对连接产物进行菌落PCR筛选的过程为：将连接产物转化大肠杆菌进行培养，挑取阳性菌落，根据sgRNA向导序列设计菌落PCR引物组，进行PCR筛选验证获得两种阳性打靶载体；所述菌落PCR引物组包含两对引物对，各引物对的正向引物为通用引物，反向引物分别为两条sgRNA引物，各引物对的具体序列如下所示：
[0021]F1：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQ ID NO.7)
[0022]R1：CTTGGTGAAGGTACCAGGA(SEQ ID NO.1)
[0023]F2：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQ ID NO.8)
[0024]R2：TCAGCCTTGATGCGCTGCT(SEQ ID NO.2)。
[0025]作为一种优选技术方案，上述方法的步骤(3)中所述筛选验证的过程为：
[0026](Ⅰ)将两种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC
‑
J2，经嘌呤霉素药筛，提取细胞基因组DNA，在敲除本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪UGT2C1基因的sgRNA向导序列，其特征在于，该sgRNA向导序列包括sgRNA1和sgRNA2：sgRNA1:CTTGGTGAAGGTACCAGGA；sgRNA2:TCAGCCTTGATGCGCTGCT。2.一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪UGT2C1基因的双链DNA，其特征在于，该双链DNA包括(1)～(2)组双链DNA：(1)sgRNA1F:5
’‑
CACCGCTTGGTGAAGGTACCAGGA
‑3’
，sgRNA1R:5
’‑
AAACTCCTGGTACCTTCACCAAGC
‑3’
；(2)sgRNA2F:5
’‑
CACCGTCAGCCTTGATGCGCTGCT
‑3’
，sgRNA2R:5
’‑
AAACAGCAGCGCATCAAGGCTGAC
‑3’
。3.一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪UGT2C1基因的敲除载体，其特征在于，该载体采用以下步骤构建：(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪UGT2C1基因的转录本CDS序列设计如权利要求1所述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5
’
端添加CACC，若sgRNA 5
’
端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5
’
端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如权利要求2中所述的两组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物，对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，获得两种阳性打靶载体即为靶向敲除猪UGT2C1基因的敲除载体。4.一种基于CRISPR/Cas9技术特异性靶向敲除猪UGT2C1基因的细胞系，其特征在于，该细胞系为将权利要求3中所述的两种阳性打靶载体混合电转入IPEC
‑
J2细胞并进行筛选和验证得到的。5.一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪小肠上皮细胞系中UGT2C1基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪UGT2C1基因的转录本CDS序列设计如权利要求1所述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5
’
端添加CACC，若sgRNA 5
’
端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5
’
端添加碱基AAAC，形...

【专利技术属性】
技术研发人员：包文斌，徐亚菲，吴圣龙，王海飞，吴正常，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：