CX3CR1基因人源化的非人动物及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种CX3CR1基因人源化的非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人CX3CR1蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人源化CX3CR1蛋白，可以作为人CX3CR1信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明专利技术还提供了一种人源化CX3CR1蛋白、一种人源化CX3CR1基因、一种CX3CR1基因的靶向载体，以及上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。

【技术实现步骤摘要】
CX3CR1基因人源化的非人动物及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CX3CR1基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]CX3CR1（C
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X3
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C motif chemokine receptor 1）又名V28，是趋化因子受体，属于7次跨膜蛋白，是G蛋白受体成员之一。CX3CR1主要表达在单核细胞、巨噬细胞、DC细胞、T细胞、NK细胞、小胶质细胞等。根据趋化受体与趋化因子结合部位不同，将其分为4类：CX3CR1、CXCR1
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CXCR5、XCR1、CCR1
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CCR9。在外周血中，CX3CR1多位于单核细胞和白细胞的细胞膜上，既参与细胞的趋化作用，也与细胞的粘附作用有关。炎症细胞从外周循环中到达炎症部位是一个动态的、多变的过程，在此过程中，CX3CR1起了重要的作用。
[0003]随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因（即遗传因子）的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战（Scheer N, Snaith M, Wolf CR, Seibler J. Generation and utility of genetically humanized mouse models, Drug Discov Today; 18(23
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24):1200
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11, 2013）。
[0004]鉴于CX3CR1在免疫性疾病等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化CX3CR1信号通路相关的非人动物模型。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面，提供了一种CX3CR1基因人源化改造的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包括编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸序列，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列构建至非人动物CX3CR1基因座。
[0006]优选的，所述的非人动物的基因组中包括SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列构建至非人动物CX3CR1基因座。
[0007]优选的，所述的非人动物的基因组中包含人CX3CR1核苷酸序列的2号外显子的部分；其中，所述人CX3CR1核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含2号外显子中编码人CX3CR1蛋白的核苷酸序列，优选的，2号外显子的部分至少包含从2号外显子5
’
端第10个核
苷酸开始至长度为1059bp、1060bp、1061bp、1062bp、1063bp、1064bp、1065bp、1066bp、1067bp或1068bp的核苷酸序列，优选的，为1068bp的核苷酸序列。
[0008]优选的，所述的构建方法包括用包含人CX3CR1核苷酸序列的2号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物CX3CR1基因座上，进一步优选的，用包含人CX3CR1核苷酸序列的2号外显子的部分核苷酸序列构建至非人动物CX3CR1基因座；其中，所述人CX3CR1基因的2号外显子的部分至少包含编码人CX3CR1蛋白的核苷酸序列，优选的，2号外显子的部分至少包含从2号外显子5
’
端第10个核苷酸开始至长度为1059bp、1060bp、1061bp、1062bp、1063bp、1064bp、1065bp、1066bp、1067bp或1068bp的核苷酸序列，优选的，为1068bp的核苷酸序列。
[0009]优选的，替换至非人动物CX3CR1基因座为替换非人动物与NCBI登录号为NC_000075.7的第119880336
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119881400所示序列相同的核苷酸序列。
[0010]优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化CX3CR1基因的核苷酸序列构建至非人动物CX3CR1基因座。
[0011]优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化CX3CR1蛋白的核苷酸序列构建至非人动物CX3CR1基因座。
[0012]优选的，所述的构建方法包括插入、翻转、敲除或替换。
[0013]更优选的，所述的构建方法是替换，所述的替换是将非人动物CX3CR1基因中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列进行替换。
[0014]优选的，所述的构建至非人动物CX3CR1基因座为替换至非人动物内源CX3CR1基因中包含编码非人动物2号外显子的部分核苷酸序列，其中，所述非人动物CX3CR1基因的2号外显子的部分至少包含2号外显子中编码非人动物内源CX3CR1蛋白的核苷酸序列，优选的，2号外显子的部分至少包含从2号外显子5
’
端第10个核苷酸开始至长度为1056bp、1057bp、1058bp、1059bp、1060bp、1061bp、1062bp、1063bp、1064bp或1065bp的核苷酸序列，优选的，为1065bp的核苷酸序列。
[0015]本专利技术所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
[0016]优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化CX3CR1蛋白,同时内源CX3CR1蛋白的表达降低或缺失。
[0017]优选的，所述的人源化CX3CR1蛋白包含人CX3CR1蛋白的全部或部分，进一步优选的，包含与SEQ ID NO：2具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：2一致的氨基酸序列。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化CX3CR1蛋白包含下列组中的一种：a）SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分或全部；b）与SEQ ID NO：2所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；c）与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；d）具有SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CX3CR1基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸序列替换至非人动物CX3CR1基因座。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列替换至非人动物CX3CR1基因座。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的替换至非人动物CX3CR1基因座为替换非人动物CX3CR1基因中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列，所述的非人动物为小鼠或大鼠。4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人源化CX3CR1蛋白，同时内源CX3CR1蛋白的表达降低或缺失，所述的人源化CX3CR1蛋白包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。5.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人源化CX3CR1基因，所述的人源化CX3CR1基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。6.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5
’
臂和/或3
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臂，所述的5
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臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的3
’
臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。7.一种CX3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕锐利，张赞，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：