一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用技术

一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用，属于基因工程技术领域。为了解决目前对于12种呼吸道病毒生物分类困难，特异性差的难题，本发明专利技术对NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息的分析，得到特异性高、保守性好的各呼吸道病毒的基因作为靶基因，并根据靶基因设计多重引物和探针，进而通过优化获得多重PCR反应体系，得到了一种可以快速检测12种呼吸道病毒的方法，利用该方法可以实现通过一次PCR快速检测出样品中是否含有12种呼吸道病毒。12种呼吸道病毒。12种呼吸道病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用。

技术介绍

[0002]传染病是一类让国际卫生组织及各大医院、疾病控制中心对之时刻保持高度警惕的一类疾病，可以在人与人，动物与动物，人与动物之间相互感染传播。传染病的暴发和流行对人类的生命财产构成了巨大的威胁，传染病可以在很短时间内就能在全球各个城市大范围的流行，严重威胁人类。尤其是呼吸道病毒引发的疾病，如何高效鉴别疑似，做到“早发现，早诊断，早隔离，早治疗”，成为病毒感染治疗的关键手段；尤其是2020年新冠病毒的出现和暴发，让我们认识到病毒分类和检测的重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术为了解决目前对于12种呼吸道病毒生物分类困难，特异性差的难题，提供了一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
[0004]步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到具有特异性高和保守性的各呼吸道病毒的基因作为靶基因；
[0005]步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针；
[0006]步骤三、利用步骤二获得的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。
[0007]进一步地限定，所述12种呼吸道病毒为：2019
‑
nCoV、HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MERS、HKU1、RNA人偏肺病毒、RNA甲型流感病毒、RNA乙型流感病毒、RNA副流感病毒和RNA呼吸道合胞病毒。
[0008]进一步地限定，步骤一所述靶基因的获得方法具体为：
[0009](1)对NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息分别进行共线性分析，得到基因组中特异性的基因；
[0010](2)通过比较基因组学分析确定基因组中特异性基因与NCBI库中不具有同源特异性的序列作为候选基因；
[0011](3)将候选基因在目的病毒基因组数据中进行检索，确定上下游基因保守性，避开高突变区域，用简并碱基的形式标注出变异性的碱基；
[0012](4)对候选基因进行验证，将具有特异性和保守性的候选序列作为靶基因。
[0013]进一步地限定，步骤二所述多重引物为：
[0014]2019
‑
nCov病毒靶基因的上下游引物：
[0015]2019
‑
nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；
[0016]2019
‑
nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；
[0017]2019
‑
nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；
[0018]2019
‑
nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；
[0019]HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：
[0020]HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；
[0021]HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；
[0022]HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：
[0023]HCoVOC43 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.7所示；
[0024]HCoVOC43 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.8所示；
[0025]HCoVNL63病毒靶基因的上下游引物：
[0026]HCoVNL63 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.9所示；
[0027]HCoVNL63 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.10所示；
[0028]SARS病毒靶基因的上下游引物：
[0029]SARS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.11所示；
[0030]SARS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.12所示；
[0031]MERS病毒靶基因的上下游引物：
[0032]MERS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.13所示；
[0033]MERS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.14所示；
[0034]HKU1病毒靶基因的上下游引物：
[0035]HKU1 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.15所示；
[0036]HKU1 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.16所示；
[0037]RNA人偏肺病毒靶基因的上下游引物：
[0038]HMPV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.17所示；
[0039]HMPV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.18所示；
[0040]RNA甲型流感病毒靶基因的上下游引物：
[0041]H3N2 M 1 W1 F序列如SEQ ID No.19所示；
[0042]H3N2 M 1 W1 R序列如SEQ ID No.20所示；
[0043]H1N1 HA 2 W1 F序列如SEQ ID No.21所示；
[0044]H1N1 HA 2 W1 R序列如SEQ ID No.22所示；
[0045]H3N2 HA 1 W1 F序列如SEQ ID No.23所示；
[0046]H3N2 HA 1 W1 R序列如SEQ ID No.24所示；
[0047]H1N1 M 2 W1 F序列如SEQ ID No.25所示；
[0048]H1N1 M 2 W1 R序列如SEQ ID No.26所示；
[0049]RNA乙型流感病毒靶基因的上下游引物：
[0050]IFB NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.27所示；
[0051]IFB NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.28所示；
[0052]IFB NP 2 W1 F序列如SEQ ID No.29所示；
[0053]IFB NP 2 W1 R序列如SEQ ID No.30所示；
[0054]RNA副流感病毒靶基因的上下游引物：
[0055]HPIV4 NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.31所示；
[0056]HPIV4 NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.32所示；
[0057]RNA呼吸道合胞病毒靶基因的上下游引物：
[0058]RSVN 1 W1 F序列如SEQ ID No.33所示；
[0059]RSVN 1 W1 R序列如SEQ ID No.34所示；
[0060]进一步地限定，步骤二所述探针为：
[0061]H3N2 M 1 W1 E：TGTTCACGCTCACCG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到具有特异性和保守性的各呼吸道病毒的基因作为靶基因；步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针；步骤三、利用步骤二获得的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述12种呼吸道病毒为：2019
‑
nCoV、HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MERS、HKU1、RNA人偏肺病毒、RNA甲型流感病毒、RNA乙型流感病毒、RNA副流感病毒和RNA呼吸道合胞病毒。3.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤一所述靶基因的获得方法具体为：(1)根据NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息，查找每类病毒的不同的基因组序列，然后使用DNAMAN软件对基因组序列进行序列比对；(2)检索出基因组特异性的基因，并且利用blast软件和nt数据库进行比对，确定基因组中特异性基因与NCBI库中不具有同源特异性的序列作为候选基因；(3)将候选基因在目的病毒基因组数据中进行检索，确定上下游基因保守性，避开高突变区域，用简并碱基的形式标注出变异性的碱基；(4)对候选基因进行验证，将具有特异性和保守性的候选序列作为靶基因。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述不具有同源特异性是指同源性不高于60％。5.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤二所述多重引物为：2019
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nCov病毒靶基因的上下游引物：2019
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nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；2019
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nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；2019
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nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；2019
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nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：HCoVOC43 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.7所示；HCoVOC43 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.8所示；HCoVNL63病毒靶基因的上下游引物：HCoVNL63 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.9所示；HCoVNL63 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.10所示；SARS病毒靶基因的上下游引物：SARS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.11所示；SARS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.12所示；
MERS病毒靶基因的上下游引物：MERS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.13所示；MERS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.14所示；HKU1病毒靶基因的上下游引物：HKU1 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.15所示；HKU1 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.16所示；RNA人偏肺病毒靶基因的上下游引物：HMPV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.17所示；HMPV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.18所示；RNA甲型流感病毒靶基因的上下游引物：H3N2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志岩，郭方，刘珍，郑青松，
申请(专利权)人：哈尔滨星云医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：