检测新生儿黄疸UGT1A1基因型和GST基因缺失型的引物、探针及荧光PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于同时检测与新生儿黄疸相关基因UGT1A1基因型和GST基因缺失型的引物、探针、荧光PCR试剂盒。所提供的引物、探针可在实时荧光定量PCR技术平台上检测UGT1A1基因*6型与*28型，GST基因GSTT1型与GSTM1型两个多态性位点及两个缺失型核苷酸类型。使用所述的引物、探针、试剂盒其检测结果具有快速高效、准确便捷、灵敏度高、特异性好、且费用低的特点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
检测新生儿黄疸UGT1A1基因型和GST基因缺失型的引物、探针及荧光PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因型检测
，特别涉及新生儿黄疸类型(生理性及病理性)相关基因的多态性检测试剂盒、引物、反应体系、探针。

技术介绍

[0002]新生儿黄疸是新生儿时期最常见临床症状之一，是由于新生儿血清胆红素代谢异常引起血液中胆红素水平升高，而出现以皮肤、黏膜及巩膜黄染为特征的病症。新生儿黄疸分为生理性和病理性，生理性黄疸是指单纯因胆红素代谢特点引起的暂时性黄疸，而当血清胆红素超过生理性黄疸的诊断标准后，可发展成为病理性高胆红素血症(即病理性黄疸)，若得不到及时诊断和治疗，可能会引起重症胆红素脑病，该病可严重影响新生儿神经系统，导致核黄疸，并遗留不同程度的神经系统后遗症。因此，对新生儿黄疸进行诊断和治疗时首先需确定其患病类型，并进行早期识别与干预，对患儿的长期预后具有重要的意义。目前，有关胆红素代谢关键酶的基因多态性研究是新生儿黄疸遗传因素研究的热点，而今后研究将进一步揭示基因与环境在新生儿黄疸中的作用，探索其潜在的表观遗传修饰。
[0003]人类尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A，UGT1A)家族的成员由同一基因编码，经不同RNA剪切形成各具有其自身独特的启动子区域和外显子1区域和共享外显子2
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5的9种UGT1A同工酶。UGT1A1是其中一种重要的同工酶，是肝脏中参与胆红素葡萄糖醛酸化反应唯一的相关酶类，此酶活性的完全或部分缺失使胆红素不能与葡萄糖醛酸结合形成结合胆红素，使非结合胆红素在体内堆积，导致非结合型高胆红素血症的发生。
[0004]新生儿高胆红素血症即新生儿黄疸，是新生儿期最常见的症状，发病率约60％
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80％。尽管新生儿黄疸通常是良性的，但少数新生儿黄疸会发展为严重的胆红素脑病(核黄疸)，如果不及时处理，常导致死亡或严重的后遗症。研究表明，新生儿黄疸原因除了与母乳喂养、低体重、脱水、早产等有关外，更主要的是与肝脏UGT1A1发育不完善、酶活性缺失相关。而UGT1A1表达水平及酶活性的不同则会导致成人和儿童在药物代谢及疗效上的差异。婴幼儿特别是新生儿由于代谢酶发育不成熟，容易发生药物不良反应。因此对于儿童人群，除遗传因素外，发育对药物代谢酶的影响可能起着关键作用。因此进行UGT1A1发育调控的研究是控制新生儿血胆红素在正常水平的关键环节。
[0005]遗传多态性是导致药物疗效及毒性反应个体差异的重要原因之一，因为我国人群中主要存在的基因型是UGT1A1*6(rs 4148323)，因此我们应着手开发适合中国人群特点的UGT1A1*6及UGT1A1*28(rs 8175347)联合检测试剂盒，在临床上用于检测新生儿黄疸基因。UGT1A1基因1号外显子的211G>A(UGT1A1*6，rs 4148323)错义突变在一个大规模的全基因组关联研究分析中发现与血清胆红素浓度密切相关。而UGT1A1基因启动子区A(TA)6TAA
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A(TA)7TAA(UGT1A1*28，rs 8175347)变异位点通过影响UGT1A1基因启动子区TATA盒，影响UGT1A1基因的表达，进而增加新生儿核黄疸的发生率。
[0006]UGT1A1基因位于染色体2q37，有5个外显子组成，是UGT1家族的重要基因，主要分布于肝脏，是肝脏中唯一具有胆红素葡萄糖醛酸化反应活性的酶，可使胆红素与葡萄糖醛酸结合形成结合胆红素；同时也是调节胆红素清除的关键酶，在胆红素代谢中起重要作用。UGT1A1*6的多态性是指在第一个外显子211位，野生型：G/G，杂合突变型：G/A，纯合型A/A。该基因第一外显子转录起始点上游为启动子区域，其突变类型包括启动子区域“TA”碱基序列插入突变((TA)6TAA>(TA)7TAA)；外显子区域的单碱基杂合突变Gly71Arg(211G>A)、Pro229Gln、Arg367Gly等。该基因编码序列的突变可导致UGT结构异常，出现酶结合功能的缺陷或丧失，而启动序列核苷酸的多态性则导致表达能力下降引起酶活性降低，从而使非结合胆红素在体内蓄积，是新生儿黄疸发生发展的高危因素。
[0007]谷胱甘肽硫基转移酶(glutathione S
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transferase，GST)是参与机体解毒的重要超家族酶系，是Ⅱ相代谢的核心酶之一。GSTM1和GSTT1是GST超基因家族中的明星基因，GSTM1主要在肝脏中表达，GSTT1则主要在肝脏和肾脏中表达。若机体内GSTM1和GSTT1基因片段缺失会导致GST活性降低，从而影响胆红素从血浆转运至肝细胞滑面内质网，导致新生儿黄疸的发生。有相关研究资料表明，GSTM1和GSTT1缺失型比列较高且具有明显的种族和地域差异，且GSTM1缺失基因型新生儿总胆红素水平较GSTM1野生型新生儿高。因此，GSTM1和GSTT1基因突变是影响新生儿黄疸发病的因素之一。但目前，大多数学者将GST基因突变的研究主要集中在与肿瘤的关系，而在与新生儿高胆红素血症方面的相关研究相对较少。
[0008]目前，对新生儿黄疸检测的主要基因有UGT1A1*6及UGT1A1*28，检测方法主要有血清胆红素测定、血清PCT检测及PCR
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Sanger测序法，而传统常规的PCR
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Sanger测序法虽然是公认的检测基因分型的“金标准”，但检测周期长、检测通量低，所以对于多基因多位点的检测并不适用，而与普通PCR相比，实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real
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time Quantitative polymerase chain reaction,RT
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PCR)是对整个PCR过程中扩增DNA的累计速率绘制动态变化图，消除在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题，且其具有分型准确，操作简便快捷、精确性好、敏感度高、支持批量检测及使用广泛等优点。特异性MGB探针是在普通Taqman探针的5
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端添加MGB基团，提高探针与模板结合物的退火温度(10℃左右)，探针与模板单碱基不匹配即可抑制两者的结合，从而提高了探针与DNA模板结合的特异性，适合靶基因单个碱基突变的基因型检测。同时，利用特异性MGB探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异性Taq酶的使用，在实时PCR技术平台上实现对样本DNA靶序列基因型进行定性检测。
[0009]Taqman
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MGB探针法是商业化试剂盒最主流的检测方法，是采用两种荧光基团(常用FAM、VIC)分别标记野生型与突变型：1)检测野生型样本时，仅有野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的野生型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；2)检测突变型样本时，仅有突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的突变型探针的荧光基团被切割，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针，其特征在于：(1)检测基因UGT1A1*6SNP位点rs 4148323多态性的引物和探针，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的UGT1A1 G211A上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的UGT1A1 G211A下游引物，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的UGT1A1G211A 211G探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的UGT1A1 G211A 211A探针，且UGT1A1 G211A 211G探针的5
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端标记有HEX，3
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端标记有MGB；UGT1A1 G211A 211A探针的5
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端标记有FAM，3
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端标记有MGB；(2)检测基因UGT1A1*28SNP位点rs 8175347多态性的引物和探针，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的UGT1A1*28上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的UGT1A1*28下游引物，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的UGT1A1 A(TA)6TAA探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的UGT1A1 A(TA)7TAA探针，且UGT1A1 A(TA)6TAA探针的5
’
端标记有HEX，3
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端标记有MGB，UGT1A1 A(TA)7TAA探针的5
’
端标记有FAM，3
’
端标记有MGB；(3)检测GSTM1、GSTT1基因缺失型的引物与内对照引物：检测GSTM1基因缺失型的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的GSTM1上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的GSTM1下游引物；检测GSTT1基因缺失型的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的GSTT1上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的GSTT1下游引物；所述内对照引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内对照β
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Albumin上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的内对照β
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Albumin下游引物。2.一种同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于同时检测UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括内标GAPDH系统，所述内标GAPDH系统包括内标引物和内标探针，内标引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的内标正引物F和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内标反引物R组成、内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，且内标探针的5
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端修饰有ROX荧光基团，3
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端修饰有BHQ2。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括阳性对照样本，所述阳性对照样本为UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因的5种混合液，其混合体积比为1:1:1:1:1；UGT1A1*6对照样本、UGT1A1*2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕小波，李泽东，刘芳黎，黄和飞，谷叶，李佳兴，
申请(专利权)人：昆明和合医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：