一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法技术

本发明专利技术涉及一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，包括：步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90‑1.10％过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关。本发明专利技术实现了在自然状态下对植物种子中不饱和脂肪酸的积累和分布模式的高灵敏度、快速、低成本、高效率、无毒、无污染的检测，用于筛选脂肪酸不饱和双键含量不同的种质资源。

【技术实现步骤摘要】
一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法
本专利技术涉及种子脂肪酸不饱和度的检测方法，特别是一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法。
技术介绍
不饱和脂肪酸是人体不可缺少的脂肪酸，人体不能合成油酸、亚油酸和α-亚麻酸，必须从膳食中补充，这些脂肪酸具有保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能。植物中油脂的分布呈现出显著的不均匀性，除少数植物在茎、果肉中富集外(Phytochemistry2007,68:2112–2117)，几乎都积累于植物的成熟种子中，不同植物种子中含油量及脂肪酸的构成大相径庭，即使同一种子中油脂分布也不尽相同(J.Biol.Chem.2012,287:2288–2294)。无论是研究种子发育过程油脂合成相关基因的协同作用，还是揭示碳代谢流在“源”和“库”之间如何定量转移和分配的，最后都离不开鉴定油脂及脂肪酸在种子“库”中的积累和分布情况，而植物中不饱和脂肪酸所占比重较大。因此，有必要提供一种不破坏种子结构、灵敏、高效的检测植物种子中不饱和脂肪酸的新方法。目前，检测不饱和脂肪酸的方法有近红外法、酶联免疫吸附法、碘价法、气相色谱法等(中国现代应用药学，2014，31：246–252)，除近红外法不需要破坏待测样品外，其余的方法都需要预先分离提取植物组织中的脂肪酸，但近红外法需要提前建立模型，并且依赖价格不菲的近红外分析仪(如CN201810917861.4公开一种植物油料中脂肪酸含量的近红外检测方法)；酶联免疫吸附法首先要制备质量较高的抗体，其次是较为复杂的实验流程；碘价法用到的氯化汞有剧毒，并且此方法耗时比较长。气相色谱法对进样样品要求较高，需要先进行衍生化反应，以便于仪器的检出，同样需要高昂的仪器设备平台(中国油料作物学报，2015，4：548–553)。综上所述，现有
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，实现了在自然状态下对种子中不饱和脂肪酸的积累和分布模式的高灵敏度、快速、低成本、高效率、无毒、无污染的检测。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：本专利技术提供一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，所述方法包括：步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90-1.10％过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关。本专利技术测试的化学原理是基于含不饱和键的脂肪酸类物质被过碘酸氧化后可以跟Schiff试剂发生反应进而显色。根据本专利技术的较佳实施例，所述待测种子为水稻种子，也可以是其他种子，本专利技术不限定为水稻种子，但优选是那些种子肉质为非红色的植物种子。种子肉质为红色可能会对检测有一定干扰，但也可以进一步地通过选择以该类种子的肉质颜色为第二对照背景色，取种子经步骤1-3处理前后相对白色对照背景的颜色差值为计算标准，进行定量化，再与脂肪酸不饱和度进行关联化。根据本专利技术的较佳实施例，所述待测种子可以是来源于种子出现直到完全成熟的生长发育各个时期的种子；当待测种子是完全成熟的植物种子时，在蒸馏水中于2-4℃浸泡至易于剖切；当待测种子是开花期间且较硬(软硬度恰好可供剖切)的种子时，直接剖切开；当待测种子是开花期间且较软的种子时，先在-15℃-25℃低温冷冻(至软硬度恰好可供剖切)后进行剖切；所述剖切为横切或纵切。根据本专利技术的较佳实施例，所述种子为水稻种子或其他种子。根据本专利技术的较佳实施例，所述显色液含有0.4-0.6g/L酸性品红和亚硫酸氢钠的溶液，其配制完成后在2-4℃下冷藏保存备用。根据本专利技术的较佳实施例，所述白色是指R、G、B均为255。根据本专利技术的较佳实施例，所述方法进一步包括：使用已有软件或仪器设备对待测样品图片上红色的深浅程度进行定量化，并将定量化的数值与脂肪酸不饱和度进行关联。根据本专利技术的较佳实施例，所述方法包括：步骤一：采用色差仪测定待测种子不同区域或不同种子的颜色数据L、a、b值；L表示色差值明度、a为红绿色轴分量、b为黄蓝色轴分量；或者使用Photoshop软件获取待测种子图片上选定区域的RGB值。步骤二：使用近红外法、酶联免疫吸附法、碘价法、气相色谱法中的一种或几种方法联合获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度。步骤三：按照上述步骤获得一系列的颜色数据和不饱和度值，然后采用prism统计学软件对种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度和对应的颜色数据进行相关性分析，获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度与颜色数据之间的关联系数。根据本专利技术的较佳实施例，所述红色的深浅程度采用由美国国立卫生研究院基于java开发的公共图片处理软件ImageJ(下载网址https://imagej.en.softonic.com/)，对种子图片进行分析，将种子图片中红色的深浅进行数值化，并将该数值与脂肪酸不饱和度进行关联。根据本专利技术的较佳实施例，具体步骤如下：打开软件ImageJ，选择菜单中的file，下拉菜单选择open打开待分析图片；选择图标Rectangularselections，在图片中选择待分析的目标区域；选择菜单栏中的Analyze下拉菜单的Measure；弹出对话框中的第二列即为所选择区域的平均灰度值；以RMGV表示相对平均灰度值，最大值定义为1；RMGV＝(255-区域1平均灰度值)/(255-区域2平均灰度值)/……/(255-区域n平均灰度值)，由于ImageJ定义纯白色的值为255，纯黑色的值为0，公式中用255减去待测定区域的平均灰度值，转换成与颜色深浅呈正相关的数值大小，即数值越大，对应区域颜色越深；公式中“/”表示不同区域之间测定数值的比；总脂肪酸不饱和度(DUFA)的计算公式为DUFA＝Σ[(M:n)mol×n]×106＝[(M:1)mol+(M:2)mol×2+(M:3)mol×3+……(M:n)mol×n]×106，其中M为脂肪酸碳链的长度，n为双键的个数，mol为该脂肪酸的摩尔数(质量除以该种脂肪酸的分子量)，Σ表示不同碳链和不同双键脂肪酸不饱和度的和；RDUFA表示相对总脂肪酸不饱和度，各个样品值与其中最大值的比值，最大值定义为1。本专利技术的方法可用于检测种子内任何不饱和脂肪酸不饱和度，不限于植物内源的不饱和脂肪酸，还可以对通过基因工程在植物种子内富集的EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)等外源不饱和脂肪酸进行快速检测。(三)有益效果本专利技术的有益效果是：本专利技术的原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，可以在不破坏植物种子组织结构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，其特征在于，所述方法包括：/n步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；/n步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90-1.10％过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；/n步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关。/n

【技术特征摘要】
1.一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；
步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90-1.10％过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；
步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测种子为水稻种子。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测种子可以是来源于种子出现直到完全成熟的生长发育各个时期的种子；
当待测种子是完全成熟的植物种子时，在蒸馏水中于2-4℃浸泡至易于剖切；当待测种子是开花期间且较硬的种子时，直接剖切开；当待测种子是开花期间且较软的种子时，先在-15℃-25℃低温冷冻后进行剖切；所述剖切为横切或纵切。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子为水稻种子。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显色液含有0.4-0.6g/L酸性品红和亚硫酸氢钠的溶液。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白色是指R、G、B均为255。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：使用已有软件或仪器设备对待测样品图片上红色的深浅程度进行定量化，并将定量化的数值与脂肪酸不饱和度进行关联。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
步骤一：采用色差仪测定待测种子不同区域或不同种子的颜色数据L、a、b值；L表示色差值明度、a为红绿色轴分量、b为黄蓝色轴分量；或者使用Photoshop软件获取待测种子图片上选定区域的RGB值；
步骤二：使用近红...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华梁，周梓璇，张雪辉，石晓云，杜军霞，王僧虎，
申请(专利权)人：邢台学院，
类型：发明
国别省市：河北;13