一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合DNA杂交技术，构建以DNA杂交为基础的磁传感器，该方法首先根据致病菌的基因序列设计并合成与该基因互补的正向探针和反向探针，将正向探针偶联在纳米磁颗粒表面，用于特异性地富集待测致病菌DNA片段，然后加入生物素标记的反向探针，形成DNA互补链，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(ALP)，形成“磁纳米颗粒‑DNA杂交双链‑ALP”的夹心结构，该夹心结构的含量与待测致病菌中的DNA含量成正相关。该方法不需要DNA扩增，提高了DNA分子检测的效率，拓宽了基于超顺纳米磁颗粒的低场核磁共振传感器的应用范围，进而为食源性致病菌的检测提供一种有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法
本专利技术属于分析化学和食品安全领域，具体而言，本专利技术涉及一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法。
技术介绍
食源性致病菌是导致食品安全问题的一个重要的因素，快速、高灵敏检测食源性致病菌对保障食品安全具有重要的意义。目前主要的检测方法有微生物培养法、免疫检测方法和PCR分子诊断方法。微生物培养法需要较长的培养时间，操作步骤繁琐，不适合现场、快速检测。免疫检测方法，主要包括酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析试纸条法。酶联免疫吸附法需要多步操作，检测时间较长，同时灵敏度也不能满足样品中痕量的食源性致病菌检测的需要，而胶体金免疫层析试纸条的方法，具有检测速度快，一步操作即可完成的优势，但其灵敏度比酶联免疫吸附法还低，无法实现低浓度的食源性致病菌的检测。PCR分子诊断方法是检测致病菌的金标准，但其需要昂贵的设备和洁净的环境，并且需要多轮的扩增，不适合现场分析。因为一般生物或者食品样品中磁信号背景极低，因此基于弛豫时间信号改变的低场核磁共振生物传感器具有样品前处理简单的优点，其在食品安全、临床诊断和环境监测等领域得到越来越广泛的应用。目前，磁弛豫时间传感器主要包括：(1)基于磁颗粒状态改变的横向弛豫时间(T2)生物传感器：磁颗粒表面偶联有抗体或适配体之类的特异性生物识别分子，在均匀磁场中，通过特异性结合，目标物会诱导磁颗粒状态的变化(分散或聚集)，同时会改变磁场的均匀度进而引起周围水分子质子T2的改变；(2)将磁分离和磁弛豫时间相结合的磁弛豫时间免疫传感器：基于粒径大小不同的磁颗粒在同一磁场中分离速度的显著差异，从而将免疫磁富集和磁弛豫时间免疫分析方法结合起来，实现磁分离和磁信号检测一步完成。这些磁弛豫时间传感器都是基于超顺纳米磁颗粒产生信号，而当检测复杂样品时会造成磁颗粒自身的聚集或非特异性吸附，产生假阳性结果；另外，制备稳定性好的超顺纳米小磁颗粒的工艺比较复杂，成本也比较高，重复和稳定性都有待进一步提高，因此需要开发稳定性更好、成本更低、可操作性更强的磁信号探针。相比于超顺纳米磁颗粒，将顺磁离子作为磁信号探针有着独特的优势：(a)稳定性好、成本低，相比传统的纳米磁颗粒，顺磁离子水溶液稳定性更好，成本更低；(b)纳米磁颗粒在复杂基质中容易发生聚集，造成分析结果不稳定，但顺磁离子则可以很好地避免这个问题，因此抗干扰能力更强；(c)很多类型的氧化还原反应可以实现顺磁离子价态的转换，实现磁信号(T2)的变化，进而可以检测一系列的目标物，并且能够同时实现生化分析和免疫分析。可见，此类传感器将在众多领域发挥越来越重要的作用。Fe(III)/Fe(II)，Cu(II)/Cu(I)都是常见的顺磁离子，其不同价态的转变都可以导致横向弛豫时间(T2)或者纵向弛豫时间(T1)的改变，但Fe(III)/Fe(II)，Cu(II)/Cu(I)这两组顺磁离子价态的改变导致的T2信号变化有限，因为这两组不同价态的顺磁离子本身都有磁信号，只是磁信号由弱变强，因此该磁信号的改变不显著，很难用于复杂食品样品中痕量食源性致病菌的分析。因此，寻找一组稳定性好、磁信号零背景的顺磁离子对作为磁信号转化探针，构建一种灵敏度高的低场核磁共振生物传感器检测食源性致病菌显得尤为重要。在实验中，我们发现Mn(VII)的T2或者T1信号几乎为零，而Mn(II)的T2或者T1信号很强，因此通过将Mn(VII)还原成Mn(II)离子，即可以实现磁信号从无到有，是一种信号打开的模式，有利于提高方法的灵敏度。因此，本专利技术的主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合DNA杂交技术，构建了以DNA杂交为基础的分子诊断磁生物传感器，应用于食源性致病菌的检测(图1)。在该方法中，我们首先通过NCBI寻找食源性致病菌的基因序列，再利用数据库设计与该基因互补的正向探针和反向探针并修饰上氨基，其中正向探针偶联在羧基磁纳米颗粒表面，反向探针进行生物素化，用于特异性地杂交从待测致病菌中提取的DNA片段，形成DNA互补链。通过磁分离得到“磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针”复合物，再加入链霉亲和素标记的ALP，通过生物素-链霉亲和素系统可以最终形成“磁颗粒-DNA杂交双链-ALP”的夹心结构。该夹心结构的含量和待测致病菌中的DNA含量成正相关，这也是本方法的定量基础。由于ALP催化的Mn(VII)/Mn(II)磁信号转换系统的效率高，方法灵敏度高，因此相比传统的PCR方法，本方法不需要对待测致病菌的DNA进行扩增，进而可以大大提高检测效率，缩短检测时间。而且没有DNA扩增步骤，可以减少假阳性率的产生以及降低对周围环境的要求。因此，该ALP催化的Mn离子诱导的低场核磁共振生物传感器将为食源性致病菌的检测提供全新有力的工具。另外，相比于基于纳米磁颗粒的传统低场核磁共振生物传感器，该基于顺磁离子的传感器具有两个独特的优势：(1)稳定性好：相比于纳米磁颗粒探针，Mn离子探针的稳定性更好；(2)灵敏度更高：在该系统里面，有ALP对底物的酶促信号放大的作用，并且其产生的酶促产物(抗坏血酸)可以进一步使Mn(VII)转变为Mn(II)，实现信号的放大和读出，整个反应是一个信号级联放大的过程。
技术实现思路
为了弥补传统低场核磁共振传感器的不足，提高低场核磁共振传感器的稳定性和灵敏度，拓宽其应用的普适性。本专利技术旨在提供一种稳定性更好、灵敏度更高，能够实现食源性致病菌高效快速检测的基于DNA杂交的低场核磁共振传感器方法，为食品安全检测提供一种高效、准确、可行的解决方案。具体地，为达到此目的，本专利技术提供以下技术方案：一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：1)根据食源性致病菌的基因组DNA序列设计并合成正向探针与反向探针；2)将正向探针与磁纳米颗粒偶联，将反向探针进行生物素标记；3)提取食源性致病菌的基因组DNA，与磁纳米颗粒-正向探针偶联物以及生物素标记的反向探针进行杂交，磁分离后得到磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针复合物；4)向步骤3)获得的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异结合能力，形成磁纳米颗粒-DNA杂交双链-碱性磷酸酶的夹心复合物；5)将抗坏血酸磷酸酯溶液加入到步骤4)得到的夹心复合物中，使碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO4溶液，抗坏血酸将Mn(VII)还原成Mn(II)，低场核磁共振仪(LF-NMR)测定T2值并计算待测样品中的致病菌含量。优选地，所述磁纳米颗粒是粒径为1000nm的COOH-MNPs。优选地，所述生物素为EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin。优选地，步骤3)中所述基因组DNA的A260/A280比值为1.7～1.9。优选地，所述抗坏血酸磷酸酯溶液的浓度为15mM。优选地，所述反应液中抗坏血酸的浓度为100-400μM，所述KMnO4溶液的浓度为0.25mM，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)根据食源性致病菌的基因组DNA序列设计并合成正向探针与反向探针；/n2)将正向探针与磁纳米颗粒偶联，将反向探针用生物素进行标记；/n3)提取食源性致病菌的基因组DNA，与磁纳米颗粒-正向探针偶联物以及生物素标记的反向探针进行杂交，磁分离后得到磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针复合物；/n4)向步骤3)获得的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异亲和能力，形成磁纳米颗粒-DNA杂交双链-碱性磷酸酶的夹心复合物；/n5)将抗坏血酸磷酸酯溶液加入到步骤4)得到的夹心复合物中，碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO

【技术特征摘要】
1.一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据食源性致病菌的基因组DNA序列设计并合成正向探针与反向探针；
2)将正向探针与磁纳米颗粒偶联，将反向探针用生物素进行标记；
3)提取食源性致病菌的基因组DNA，与磁纳米颗粒-正向探针偶联物以及生物素标记的反向探针进行杂交，磁分离后得到磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针复合物；
4)向步骤3)获得的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异亲和能力，形成磁纳米颗粒-DNA杂交双链-碱性磷酸酶的夹心复合物；
5)将抗坏血酸磷酸酯溶液加入到步骤4)得到的夹心复合物中，碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO4溶液，抗坏血酸将Mn(VII)还原成Mn(II)，低场核磁共振仪测定T2值并计算待测样品中的致病菌含量。


2.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述磁纳米颗粒是粒径为1000nm的C...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，张峰，王知龙，许秀丽，
申请(专利权)人：华中农业大学，中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42