一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法，属于纳米生物分析检测领域。本发明专利技术通过CuBi

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法
本专利技术属于纳米生物分析检测领域，具体涉及一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法。
技术介绍
组蛋白乙酰化是调节基因转录的关键因素之一，并参与真核基因表达和其他重要的生命过程以及其它翻译后修饰的过程[PetersonC.L.；LanielM.A.Curr.Biol.2004,14,R546–R551]。而组蛋白乙酰转移酶(HAT)充当组蛋白乙酰化的催化酶，使用乙酰辅酶A作为乙酰基供体，将乙酰基转移至底物肽，同时产生大量副产物辅酶A。已有证据表明，组蛋白乙酰转移酶水平与多种人类疾病的发生有密切关系，例如癌症，白血病，老年痴呆症，艾滋病和心血管疾病等[HanY.；LiH.Anal.Chem.2015,87,9179-9185]。因此开发简单、快速、灵敏和选择性检测组蛋白乙酰转移酶的方法具有重要意义。到目前为止，已报道一些用于组蛋白乙酰转移酶检测的方法，包括放射性同位素标记[TurlaisF.；HardcastleA.Anal.Biochem.2001,298,62-68]，电化学发光[ChenH.；LiuX.BiosensBioelectron.2019,126,535-542]，酶联免疫吸附测定(ELISA)[KuningerD.；LundbladJ.J.Biotechnol.2007,131,253-260]，比色法[ZhenZ.；TangL.J.Anal.Chem.2012,84,3614-3620]荧光法[GhadialiJ.E.；LoweS.B.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3417-3420]等。然而，传统的放射性同位素标记方法具有放射性危害，费时且标记过程成本高等不足。对于ELISA和比色法等基于抗体的识别技术来说，存在不同批次的抗体之间的差异，抗体标记成本高以及探针制备过程复杂等缺点。而荧光法则需要昂贵的仪器和复杂的荧光标记过程。因此，迫切需要开发一种低成本，高效且灵敏的组蛋白乙酰转移酶检测方法。近年来，基于纳米材料的分析方法具有快速、灵敏以及易微型化等诸多优点引起了广泛的关注。纳米酶是一类具有酶活性的纳米材料，由于其稳定性好，酶活性高且容易调节、成本低等特点同样受到了研究人员的密切关注[WeiH.；WangE.Chem.Soc.Rev.2013,42,6060–6093；LinY.H.；RenJ.S.Acc.Chem.Res.2014,47,1097–1105]。目前基于纳米材料的纳米酶在生物传感[AnjaniP.Nagvenkar.；AharonGedanken.ACSAppl.Mater.Interfaces.2016,8,22301-22308；JeonghyoKim.ACSAppl.Mater.Interfaces.2018,10,12534-12543]，疾病诊断和治疗[MuX.Y.；WangJ.Y.ACSNano,2019,13,1870-1884]以及污染物降解[LiS.Q.；HouY.J.ACSAppl.Mater.Interfaces.2020,12,2581–2590]等领域得到了越来越多的应用。但是，其在组蛋白乙酰转移酶的检测方面的应用尚未报道。
技术实现思路
本专利技术发现了一种新型的CuBi2O4/Bi4[Fe(CN)6]3纳米酶，并首次将纳米酶用于组蛋白乙酰转移酶(HATp300)的比色法测定。本专利技术利用纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法，基于CuBi2O4与K4[Fe(CN)6]原位反应生成具有模拟过氧化物酶活性的CuBi2O4/Bi4[Fe(CN)6]3复合物，在H2O2存在下，可以催化氧化显色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺变为蓝色，输出比色信号。当无目标物HATp300存在时，辅酶A适配体(一段单链DNA)被限制性核酸外切酶I水解，产生的产物dNMP，会优先吸附到CuBi2O4表面，抑制了CuBi2O4与K4[Fe(CN)6]的反应产生CuBi2O4/Bi4[Fe(CN)6]3复合物，导致体系不表现模拟酶活性；当有目标物HATp300存在时，HATp300催化乙酰辅酶A将乙酰基转移至底物肽的赖氨酸的残基上，并产生大量辅酶A，使得辅酶A与体系中的辅酶A适配体进行特异性结合，以保护辅酶A适配体不被限制性核酸外切酶I水解，不产生产物dNMP，而CuBi2O4与K4[Fe(CN)6]的反应得以顺利进行产生CuBi2O4/Bi4[Fe(CN)6]3，从而输出比色信号，达到快速、灵敏检测HATp300的效果。本专利技术的目的是提供一种基于CuBi2O4/Bi4[Fe(CN)6]3纳米材料模拟过氧化物酶的组蛋白乙酰转移酶的检测方法，在HATp300的酶催化反应下，产生的辅酶A与辅酶A适配体特异性结合后，辅酶A适配体无法被限制性核酸外切酶I水解产生dNMP，CuBi2O4与K4[Fe(CN)6]的反应得以顺利进行产生CuBi2O4/Bi4[Fe(CN)6]3，从而输出比色信号，构建了一种便捷、灵敏、无标记的比色法检测HATp300的方法。具体方案如下：一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将不同浓度的HATp300与乙酰辅酶A、底物肽混合，孵育；孵育结束后，加入辅酶A适配体，继续进行孵育；孵育结束后，再加入限制性核酸外切酶I，继续进行孵育，孵育结束后，获得混合溶液；(2)向所得混合溶液中加入CuBi2O4溶液，孵育；向混合溶液中分别加入K4[Fe(CN)6]、特征显色底物3,3’,5,5’―四甲基联苯胺、缓冲溶液和H2O2，孵育；孵育结束后，使用酶标仪进行光谱扫描，获得不同浓度相应的吸光度值A；同时，测定HATp300浓度为0时测得的吸光度值A0，计算二者差值得到不同浓度相应的吸光度增值(A-A0)；(3)利用HATp300的浓度与吸光度增量构建线性关系，得到线性测定模型。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括：按照步骤(1)和步骤(2)，对待测样品进行孵育处理，测得相应的吸光度增量；然后通过步骤(3)的线性测定模型，计算得到待测样品中HATp300的浓度含量。在本专利技术的一种实施方式中，所述底物肽的组成为：RGKGGKGLGKGGAKA。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)是将20μL不同浓度的HATp300，20μL1.0mmol/L的乙酰辅酶A，20μL1.0mmol/L的底物肽混合，在20～40℃下孵育50-90min。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)是加入20μL0.1mmol/L辅酶A适配体溶液，在20～40℃下孵育6-12h。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)是加入20μL5.0U/mL限制性核酸外切酶I溶液，在30～40℃下孵育30-90min。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中CuBi2O4可通过如下方法制得：将铋盐分散在含浓硝酸的水中，获得澄清溶液，然后向其中滴入铜盐溶液，最后加入碱液，混匀形成含蓝绿色沉淀的混合体系；将混合体系转移至高压釜中进行反应；反应结束本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)将不同浓度的组蛋白乙酰转移酶溶液与乙酰辅酶A、底物肽混合，孵育；孵育结束后，加入辅酶A适配体，继续进行孵育；孵育结束后，再加入限制性核酸外切酶I，继续进行孵育，孵育结束后，获得相应的混合溶液；/n(2)向步骤(1)所得含不同浓度的组蛋白乙酰转移酶的混合溶液中加入CuBi

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米酶检测组蛋白乙酰转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将不同浓度的组蛋白乙酰转移酶溶液与乙酰辅酶A、底物肽混合，孵育；孵育结束后，加入辅酶A适配体，继续进行孵育；孵育结束后，再加入限制性核酸外切酶I，继续进行孵育，孵育结束后，获得相应的混合溶液；
(2)向步骤(1)所得含不同浓度的组蛋白乙酰转移酶的混合溶液中加入CuBi2O4溶液，孵育；孵育结束后，加入K4[Fe(CN)6]、特征显色底物3,3’,5,5’―四甲基联苯胺、缓冲溶液和H2O2，继续孵育；孵育结束后，使用酶标仪进行光谱扫描，获得不同浓度相应的吸光度值A；同时，测定HATp300浓度为0时测得的吸光度值A0，计算二者差值得到不同浓度相应的吸光度增值(A-A0)；
(3)利用组蛋白乙酰转移酶的浓度与吸光度增量构建线性关系，得到线性测定模型。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中CuBi2O4通过如下方法制得：
将铋盐分散在含浓硝酸的水中，获得澄清溶液，然后向其中滴入铜盐溶液，最后加入碱液，混匀形成含蓝绿色沉淀的混合体系；将混合体系转移至高压釜中进行反应；反应结束后，洗涤、干燥，得到棕色粉末CuBi2O4产物。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，铜盐与铋盐的摩尔比为1:(1-5)。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王光丽，陈彦如，孙冬雪，董玉明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32