一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于微生物发酵领域，公开了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明专利技术所述的枯草芽孢杆菌其为枯草芽孢杆菌菌株中purR、ribC或pyrE中至少一个基因位点发生突变。purR、ribC或pyrE至少一个基因位点突变获得的枯草芽孢杆菌菌株在本发明专利技术公开的发酵条件下积累核黄素显著增加。本发明专利技术所述的枯草芽孢杆菌为核黄素高产菌株，生产的核黄素显著增加，为核黄素的工业化生产奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。目前生产上应用的产核黄素菌种有酵母、芽孢杆菌、棒杆菌和大肠杆菌等，多为野生菌种或诱变菌种，发酵性能较差。传统生产菌种主要是由多轮物理化学诱变及结构类似物筛选获得。但由于随机诱变引入的突变点具有不确定性，使得这些菌株往往具有比较复杂的遗传背景。对于相关突变点作用的解析会耗费大量的时间和精力，也使得后续的代谢工程改造面临较大的挑战。同时，诱变获得的菌种普遍存在难转化或改造效率低等缺点。本专利技术将诱变菌株进行测序，结合理性分析，将获得的有益突变点挖掘出来，水平移植到背景清晰的枯草芽孢杆菌168菌株上，同时辅以其他理性代谢工程改造，获得高产核黄素的菌种。
技术介绍
核黄素(Riboflavin)，又称维生素B2，分子式为C17H20O6N4，分子量：376.36，其化学结构式如图1所示。核黄素是人体必需的13种维生素之一，是B族维生素的成员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，微溶于乙醇、环己醇、乙酸乙酯、苄醇和酚，不溶于乙醚、氯仿、丙酮和苯。在中性或酸性溶液中稳定，耐热、耐氧化，但在碱溶液中不稳定，加热可被破坏，光照及紫外照射引起不可逆的分解。278～282℃时分解，饱和水溶液的pH约为6.0，水溶液呈黄色并显绿色荧光。核黄素是黄素酶类的辅酶组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，以辅酶或辅基的形式参与各种酶系统反应。作为黄素蛋白的辅酶参与呼吸电子传递链及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，直接参与碳水化合物、蛋白质、脂肪的生物氧化作用，在生物体内具有多种生理功能，是生命活动不可缺少的维生素，是维持机体正常代谢和生理功能所必须的营养素。核黄素具有促进发育和细胞再生，促使皮肤、指甲、毛发的正常生长，帮助消除口腔内、唇、舌炎症，增进视力，减轻眼疲劳等功效。微生物可以自身合成核黄素，但人和动物必须从食物中获取。正常成年人血清核黄素的浓度为69～98μmol/L，人体每天需要0.3～1.8mg核黄素。核黄素成为一种重要的饲料添加剂、食品添加剂、药品和食品染料，市场每年需求约8000～10000吨。目前核黄素的生产方法主要有2种：半微生物发酵合成法和微生物发酵法。半微生物发酵合成法是先通过微生物发酵生产D-核糖，再以D-核糖为原料，与3,4-二甲代苯胺反应形成核醇二甲代苯胺，转化成偶氮染料后与巴比妥酸反应生产核黄素。该方法的优点是产品纯度较高，达到96％，主要缺点是得率较低，约60％，且需要用到大量的有机溶剂，环境污染大。微生物发酵法仅需一步发酵，具有生产成本低，环境污染小，生产周期短，产品纯度高等优点。该方法是目前核黄素工业化生产的主要方法，生产的核黄素占到市场份额的90％以上。核黄素生产菌种是微生物发酵法的核心。早期的核黄素生产菌种从丙酮丁酸梭菌，到阿舒氏假囊酵母、棉囊阿舒酵母、解朊假丝酵母等，存在发酵周期长、原料复杂、菌体粘度大、工艺复杂等问题。枯草芽孢杆菌和产氨棒状杆菌等核黄素工程菌相继构建成功，成为核黄素工业生产的主要菌种。尤其是枯草芽孢杆菌具有发酵周期短、单位高、原料易得、工艺简单、生产效率高等优势。且枯草芽孢杆菌作为重要的模式菌，其生理、生化及分子遗传学方面的研究都比较清楚，具有基因工程改造技术成熟的优势，未来仍有较大的提升空间。近年来，虽然通过代谢工程改造获得了许多高产核黄素的枯草芽孢杆菌基因工程菌，但由于我们对微生物生理及复杂代谢网络调控机制了解的局限性，运用基因工程技术对菌株继续进行改造，很难再获得核黄素产量进一步大幅度提升的菌株；而传统的诱变育种，工作量大、缺乏高效、快速的筛选方法，使得枯草芽孢杆菌在提高核黄素生产能力上受到很大程度的限制。
技术实现思路
本专利技术提供了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本专利技术所述枯草芽孢杆菌为基因工程重构菌，其携带多个有助于产核黄素的突变基因。本专利技术所述的产核黄素的枯草芽孢杆菌其获得过程为，首先将枯草芽孢杆菌168经多轮紫外诱变获得诱变菌，通过全基因组测序分析，该菌株有多个重要突变，推测与核黄素合成或分解相关。其中的3个突变基因为：突变的嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；突变的双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；突变的乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。其次，将上述3个突变基因分别通过反向遗传学手段重新引入到野生出发菌株枯草168菌株中，并进行核黄素生产测试。结果表明，三个点突变对核黄素生产均有正向作用，并且具有叠加的效果。第一方面，本专利技术提供了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株中下述至少一个位点发生了点突变：1)purRA148D：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；2)ribCD144R：双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；3)pyrEK104E：乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。在此基础上，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR的突变基因purRA148D，该突变基因如SEQNO.2所示，其编码的蛋白如SEQNO.8所示；本专利技术还提供了一种枯草芽孢杆菌双功能黄素激酶FAD合成酶RibC的突变基因ribCD144R，该突变基因如SEQNO.4所示，其编码的蛋白如SEQNO.10所示；本专利技术还提供了一种枯草芽孢杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE的突变基因pyrEK104E，该突变基因如SEQNO.6所示，其编码的蛋白如SEQNO.12所示。第二方面，本专利技术提供了一株产核黄素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.21202。该菌株具有核黄素生产能力，摇瓶水平核黄素产量可达1.65g/L。第三方面，本专利技术提供了一种产核黄素工程菌的构建方法，其包括如下步骤：(1)在出发菌株的染色体上整合了purR、ribC或pyrE的基因，其中至少一个基因存在突变；(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。优选的，本专利技术提供了一种产核黄素工程菌的构建方法，其包括如下步骤：(1)在出发菌株的染色体上整合突变的嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；以及突变的双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；以及突变的乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸；(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。其中，所述步骤(1)中的出发菌株为枯草芽孢杆菌，优选为Bacillussubtilis168；所述步骤(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株中存在下述至少一个位点发生了点突变：/n1)purR

【技术特征摘要】
1.一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株中存在下述至少一个位点发生了点突变：
1)purRA148D：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；
2)ribCD144R：双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；
3)pyrEK104E：乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。


2.如权利要求1所述的产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.21202。


3.一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQNO.2所示；编码的蛋白如SEQNO.8所示。


4.一种枯草芽孢杆菌双功能黄素激酶FAD合成酶RibC的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQNO.4所示；编码的蛋白如SEQNO.10所示。


5.一种枯草芽孢杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQNO.6所示；编码的蛋白如SEQNO.12所示。


6.一种产核黄素工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)在出发菌株的染色体上整合了purR、ribC或pyrE的基因，其中至少一个基因存在突变；
(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。


7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，胡丹，常利斌，龚华，李岩，赵津津，
申请(专利权)人：通辽梅花生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15