本发明专利技术公开了一种通过代谢工程改造提高蒎烯生物合成的方法。即选取耐高渗透压的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018转化葡萄糖发酵生产蒎烯。该酵母对蒎烯耐受性可达1g/L，有效克服了蒎烯对宿主生产菌的生长抑制，通过代谢工程改后蒎烯的产量达到40mg/L，较初始产量(0.38mg/L)提高了100多倍。本发明专利技术的制备方法具有操作方便、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广等特点。
【技术实现步骤摘要】
一种通过代谢工程改造提高蒎烯生物合成的方法
本专利技术涉及一种通过代谢工程改造提高蒎烯生物合成的方法，属于微生物
技术介绍
蒎烯(pinene)，分子式C10H16，是一种重要的单萜类天然化合物，有α-和β-蒎烯两种异构体，二者均存在于多种天然精油中，以蒎烯为初始原料合成香料已成为工业合成香料的一个重要组成部分。蒎烯具有特殊的分子结构，是一种供电子体，其可与受电子体等进行自由基交替共聚，形成电荷转移络合物，从而合成性能优异的聚合物，扩大了其聚合物的应用范围。松节油中含有58～65％的α-蒎烯和30％的β-蒎烯，其二聚体具有与战术燃料JP-10相当的高体积能量，可作为现有喷气机燃料(如战术燃料JP-10和降冰片二烯二聚体的混合物RJ-5)的替代燃料。除此之外，蒎烯单体还具抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗抑郁和镇痛等功效，可作为多种药物的主要药理活性物，例如人们常用的治疗支气管炎的桉柠蒎肠溶胶囊。目前蒎烯主要通过化学法合成，即采用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提取。这种方法对设备要求较高，分离提取难度大、成本高，同时造成了大量自然资源的破坏。随着代谢工程和合成生物学的迅速发展，绿色可持续发展的微生物合成技术为先进生物燃料的制造提供了替代策略，即可利用大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等遗传背景清晰、基因操作体系成熟的模式微生物实现目标产品的高效合成。与大肠杆菌相比，酿酒酵母由于拥有更强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统，更适于蒎烯合成代谢过程中关键酶细胞色素P450蛋白的表达。但是，在酿酒酵母的蒎烯代谢合成过程中，蒎烯的产量不高，并且由于蒎烯对酿酒酵母具有生长抑制的作用，更加的限制了采用酿酒酵母生产蒎烯，专利技术人课题组前期的研究中，发现在产甘油假丝酵母转化葡萄糖发酵生产蒎烯，产量仅仅为0.38mg/L，远远不能达到工业生产的需要，因此如何得到一种操作简单、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广高产蒎烯的方法成为研究的热点和难点。
技术实现思路
为了得到一种操作简单、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广的高产蒎烯的方法，本专利技术提供了一种重组产甘油假丝酵母，同时过表达了ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、HMGR、ERG20、IDI或IDI突变体IDI-1基因，并表达了来源于Pinustaeda的蒎烯合酶；所述IDI-1是在核氨酸序列如SEQIDNO.1所示的IDI的基础上，将第139位的半胱氨酸进行突变得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述IDI-1是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的IDI的基础上，将第139位的半胱氨酸突变为色氨酸得到的，命名为C139W。在本专利技术的一种实施方式中，所述蒎烯合酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述HMGR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述ERG20的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述IDI-1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述ERG10的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述ERG13的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述ERG12的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述ERG8的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述IDI的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于E.coli的coaA的NCBI登录号为ID:948479。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于A.thaliana的Acl的NCBI登录号为GeneID:816892。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于E.coli的IDI的NCBI登录号为GeneID:949020，命名为IDI-2。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于S.cerevisiae的IDI的NCBI登录号为GeneID:855986，命名为IDI-3。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于C.glycerinogenes的IDI的NCBI登录号为GeneID:40386068，命名为IDI-4。在本专利技术的一种实施方式中，以产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCCM93018为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，以pURGAP为表达载体。本专利技术还提供了一种构建上述重组产甘油假丝酵母的方法，包括以下步骤：(1)化学合成蒎烯合酶基因，并将蒎烯合酶基因连接到质粒上，得到重组质粒；(2)将核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的ERG10的基因、核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的ERG13的基因、核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的ERG12的基因、核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的ERG8的基因、编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的HMGR的基因、编码核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的ERG20的基因、编码核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的IDI-1的基因或或编码核苷酸序列如SEQIDNO.10所示IDI的基因通过同源重组的方法整合到产甘油假丝酵母多拷贝整合位点BamHI(GGATCC)，得到表达宿主；(3)将步骤(1)得到重组质粒转入步骤(2)得到的表达宿主中，构建得到重组产甘油假丝酵母。在本专利技术的一种实施方式中，所述蒎烯合酶的核氨酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，包括以下步骤：(1)化学合成核氨酸序列如SEQIDNO.2所示的蒎烯合酶基因，将蒎烯合酶基因采用BamHI和KpnI酶切之后连接到pURGAP质粒上，构建重组质粒，采用SacI线性化重组质粒；(2)将核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的ERG10的基因、核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的ERG13的基因、核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的ERG12的基因、核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的ERG8的基因、编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的HMGR的基因、编码核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的ERG20的基因、编码核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的IDI-1的基因或编码核苷酸序列如SEQIDNO.10所示IDI的基因分别通过同源重组的方法整合到产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCCM93018多拷贝整合位点BamHI(GGATCC)，得到表达宿主；(3)采用醋酸锂转化法将线性化重组质粒转化到产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCCM93018基因组中，构建高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒pURGAP公开于公开号为CN1031734本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组产甘油假丝酵母，其特征在于，同时过表达了ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、HMGR、ERG20和IDI或其突变体基因，并表达了来源于Pinus taeda的蒎烯合酶；/n所述IDI突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的IDI的基础上，将第139位的半胱氨酸进行突变得到的，命名为IDI-1。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组产甘油假丝酵母，其特征在于，同时过表达了ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、HMGR、ERG20和IDI或其突变体基因，并表达了来源于Pinustaeda的蒎烯合酶；
所述IDI突变体是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的IDI的基础上，将第139位的半胱氨酸进行突变得到的，命名为IDI-1。
2.如权利要求1所述的重组产甘油假丝酵母，其特征在于，所述IDI-1是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的IDI的基础上，将第139位的半胱氨酸突变为色氨酸得到的。
3.如权利要求1或2所述的重组产甘油假丝酵母，其特征在于，所述蒎烯合酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
4.如权利要求1-3任一所述的重组产甘油假丝酵母，其特征在于，所述HMGR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；优选的，所述ERG20的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；优选的，所述ERG10的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；优选的，所述ERG13的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；优选的，所述ERG12的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；优选的，所述ERG8的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。
5.如权利要求1-4任一所述的重组产甘油假丝酵母，其特征在于，以产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCCM93018为宿主。
6.如权利要求1-5任一所述的重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，马腾飞，陆信曜，宗红，任全路，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。