【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】处理核酸样本的方法相关申请本申请要求2018年5月16日提出的第62/672,480号美国临时申请以及2018年12月13日提出的第62/779,371号美国临时申请的优先权，所述临时申请中的每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
用于研究活细胞中的基因表达的常用技术为由核糖核酸(RNA)分子产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)。这种技术提供了由活细胞研究RNA的方式，这避免了直接分析本身不稳定的RNA。作为cDNA合成中的第一步，将来自生物体的RNA分子从生物体细胞或组织的萃取物中分离。分离信使RNA(mRNA)之后，使用例如利用oligodT(脱氧胸苷核苷酸的短序列)的亲和色谱法等方法，将寡核苷酸序列退火到已分离的mRNA分子上，并且可以将RNA/DNA引物用作模板来利用具有逆转录酶活性的酶产生RNA序列的cDNA拷贝。因此，mRNA的逆转录是多种形式的基因表达分析中的关键步骤。通常，通过引物延伸或聚合酶链式反应将mRNA逆转录到cDNA中以供后续分析。逆转录酶同时具有RNA引导的DNA聚合酶活性和DNA引导的DNA聚合酶活性。RNA模板的逆转录可能需要引物序列，该引物序列被退火到RNA模板上以便从引物的3'OH启动DNA合成。在室温下，逆转录酶可以允许形成完全匹配以及不匹配的DNA/RNA杂交体。在一些情况下，逆转录酶可能由于这类非特异性引发事件而产生大量非特异性cDNA产物。非特异性逆转录产物会干扰后续cDNA分析，例如cDNA测序、实时聚合酶链式反应(PCR)和碱性琼脂糖凝胶电泳等等。由非特异性逆...
【技术保护点】
1.一种用于产生非天然存在的酶的方法，其包含：/na)在宿主中表达编码所述非天然存在的酶的异源序列，其中所述非天然存在的酶包含：/ni)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转座子的手指域；/nii)来源于R2逆转录转座子的拇指域；/niii)来源于R2逆转录转座子的手掌域；以及/niv)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域；/nb)从所述宿主纯化所述非天然存在的酶，由此产生所述非天然存在的酶。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180516 US 62/672,480;20181213 US 62/779,3711.一种用于产生非天然存在的酶的方法，其包含：
a)在宿主中表达编码所述非天然存在的酶的异源序列，其中所述非天然存在的酶包含：
i)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转座子的手指域；
ii)来源于R2逆转录转座子的拇指域；
iii)来源于R2逆转录转座子的手掌域；以及
iv)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域；
b)从所述宿主纯化所述非天然存在的酶，由此产生所述非天然存在的酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非天然存在的酶进一步包含融合物标签分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述融合物标签分子使所述非天然存在的酶稳定。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述融合物标签分子选自由以下组成的组：Fh8、MBP、NusA、Trx、SUMO、GST、SET、GB1、ZZ、HaloTag、SNUT、Skp、T7PK、EspA、Mocr、Ecotin、CaBP、ArsC、IF2-域I、IF2-域I衍生的标签、RpoA、SlyD、Tsf、RpoS、PotD、Crr、msyB、yjgD、rpoD和His6。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述融合物标签分子选自由以下组成的组：His标签、His6标签、钙调蛋白标签、CBP、CYD(共价但可解离的NorpD肽)、StrepII、FLAG标签、HA标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Softag-1、Softag-3、V5标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag、B、HPC(蛋白C重链)肽标签、GST、MBP、生物素、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、绿色荧光蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、Strep标签和硫氧还蛋白标签。
6.根据权利要求1所述的方法，其中来自R2逆转录转座子的所述手指域、R2逆转录转座子的所述拇指域或R2逆转录转座子的所述核酸内切酶域中的至少一个来源于节肢动物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中来自R2逆转录转座子的所述手指域、R2逆转录转座子的所述拇指域或R2逆转录转座子的所述核酸内切酶域中的至少一个来源于蚕蛾。
8.根据权利要求1所述的方法，其中来自R2逆转录转座子的所述手指域、R2逆转录转座子的所述拇指域或R2逆转录转座子的所述核酸内切酶域中的至少一个来源于脊椎动物或棘皮动物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中来自R2逆转录转座子的所述手指域、R2逆转录转座子的所述拇指域或R2逆转录转座子的所述核酸内切酶域中的至少一个来源于扁虫或水螅。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述非天然存在的酶具有与SEQIDNO:1-20至少80％同一性。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主选自细菌、酵母、藻类、蓝藻细菌、真菌或植物细胞或其任何组合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主为大肠杆菌。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述非天然存在的酶包含诱变基元-1序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述诱变基元-1序列与野生型序列相比具有改良的跳跃活性。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述非天然存在的酶包含诱变基元0序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述诱变基元0序列与野生型序列相比具有改良的跳跃活性。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述非天然存在的酶包含诱变拇指序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述诱变拇指序列具有改良的单链引发效率。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述诱变拇指序列具有改良的持续合成能力。
20.一种非天然存在的酶，其包含(i)来源于R2逆转录转座子的手指域；(ii)来源于R2逆转录转座子的拇指域；以及(iii)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域。
21.根据权利要求20所述的非天然存在的酶，其中所述非天然存在的酶具有与SEQIDNO:1-20至少80％同一性。
22.一种用于同时扩增核糖核酸(RNA)分子和脱氧核糖核酸(DNA)分子的方法，其包含：
(a)提供包含所述RNA、DNA和非天然存在的酶的反应混合物，所述非天然存在的酶中的每一种包含(i)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转座子的手指域；(ii)来源于R2逆转录转座子的拇指域；(iii)来源于R2逆转录转座子的手掌域；以及(iv)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域；以及
(b)使所述反应混合物经受足以扩增所述RNA和DNA的条件，由此得到所述RNA和所述DNA的扩增产物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述DNA为来源于所述反应混合物中的RNA子集的互补DNA。
24.一种用于制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的方法，其包含：
(a)将细胞和非天然存在的逆转录酶分区在分区中，所述细胞包含核糖核酸(RNA)分子；
(b)从所述分区中的所述细胞释放所述RNA分子；以及
(c)在所述分区中，使用所述非天然存在的逆转录酶从所述RNA分子合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库，所述非天然存在的转录酶以20个核苷酸或更长核苷酸的持续合成能力合成所述cDNA文库。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非天然存在的逆转录酶具有与SEQIDNO:1-20至少80％同一性。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述分区进一步包含：
i.一个或多个受体核酸分子；和
ii.非天然存在的逆转录酶，其中所述非天然存在的逆转录酶具有与SEQIDNO:1-20至少80％同一性。
27.一种用于处理包含不同类型核糖核酸(RNA)的样本的方法，其包含在被封阻进行转录的核糖体核糖核酸(rRNA)分子存在下使用所述RNA分子合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，使得所述cDNA分子的少于30％包含来自所述rRNA分子的序列。
28.一种用于处理包含核糖核酸(RNA)的混合物的方法，其包含：
(a)在所述混合物中，将所述RNA分子片段化，得到多个RNA片段；
(b)使一个或多个单链核酸序列与所述多个RNA片段接触，所述一个或多个单链核酸序列与所述RNA片段的至少一个子集互补，由此提供一种或多种包含与所述RNA片段的所述至少所述子集杂交的所述一个或多个单链核酸序列的RNA片段复合物；以及
(c)在所述一种或多种RNA片段复合物的存在下使用逆转录酶由所述RNA合成至少一种互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子。
29.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包含：
(a)提供包含所述单链核酸分子和非天然存在的酶的反应混合物，其中所述非天然存在的酶包含：
i)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转座子的手指域；
ii)来源于R2逆转录转座子的拇指域；
iii)来源于R2逆转录转座子的手掌域；以及
iv)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域；
(b)使所述反应混合物经受足以使用所述非天然存在的酶将个别的核苷酸掺入至与所述核酸分子互补的生长链中的条件，其中所述个别的核苷酸掺入至所述生长链中得到可检测的信号；以及
(c)检测所述可检测的信号，由此对所述单链核酸分子进行测序。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸分子为RNA分子。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸分子为单链DNA分子。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件包含基于光学件的单分子测序条件。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件包含基于显微术的单分子测序条件。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件包含基于纳米孔的单分子测序条件。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件包含基于场效应晶体管的单分子测序条件。
36.一种方法，其包含：
(a)用天然存在的酶由一种或多种核糖核酸(RNA)制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，其中所述一种或多种核糖核酸(RNA)来源于受试者的原位组织或来源于所述受试者的固定离体组织，其中所述非天然存在的酶包含：
i)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转座子的手指域；
ii)来源于R2逆转录转座子的拇指域；
iii)来源于R2逆转录转座子的手掌域；以及
iv)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域；由此从所述受试者的所述原位组织或从所述受试者的所述固定离体组织产生cDNA分子；以及
(b)对(a)中所产生的所述cDNA分子进行测序。
37.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·比比罗，P·帕特尔，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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