经修饰的多能干细胞及制备和使用方法技术

本公开提供了从工程化改造的干细胞产生经修饰的T细胞的方法，以用于工程化免疫疗法的自体或同种异体环境。敲除内源性TCR或HLA表达允许工程化改造经修饰的多能干细胞，从而降低或消除移植物抗宿主病(GVHD)的风险，提供抵抗受体的T细胞和NK细胞消除的能力，并允许可控制的T细胞活性。因此，该方法允许开发具有降低的免疫反应性的T细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的多能干细胞及制备和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求于2018年2月16日提交的美国临时申请62/710,591和2018年5月18日提交的美国临时申请62/673,624的优先权，二者通过引用整体并入本文。序列表本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用整体并入本文。2019年2月14日创建的所述ASCII拷贝命名为K-1061_01_SL.txt，并且大小为2.67千字节。专利技术背景人类癌症就其本质而言是由经历遗传或表观遗传转化而变成异常癌细胞的正常细胞组成。在这情况下，癌细胞开始表达与正常细胞表达的蛋白质和其他抗原不同的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可以被人体的先天免疫系统用来特异性靶向并杀死癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来阻止免疫细胞(例如T和B淋巴细胞)成功靶向癌细胞。当前的T细胞疗法依赖于经富集或经修饰的人T细胞来靶向并杀死患者中的癌细胞。为了增加T细胞靶向和杀死特定癌细胞的能力，已经开发了方法来工程化改造T细胞以表达将T细胞导向特定靶癌细胞的构建体。嵌合抗原受体(CAR)和经工程化改造的T细胞受体(TCR)，其包含能够与特定肿瘤抗原相互作用的结合结构域，允许T细胞靶向并杀死表达特定肿瘤抗原的癌细胞。存在产生用于特异性靶向和杀死癌细胞的CAR、TCR和抗原受体修饰的T细胞的改进方法的需求。专利技术概述本公开尤其通过提供包含有效地分化为T细胞的经基因工程化改造的干细胞及其衍生物的组合物和方法解决了该需求。特别地，本公开提供了可用于自体或同种异体环境中用于工程化免疫疗法的干细胞的产生。当用于基于细胞的免疫疗法中时，本文所述的经修饰的多能干细胞可降低或消除移植物抗宿主病(GVHD)的风险，提供抵抗受体的T细胞和NK细胞消除的能力，并允许可控制的T细胞活性(例如，经工程化改造以包含自杀基因或杀死开关)。来自过继细胞疗法的T细胞应答可以由来自受体的T细胞介导。移植排斥可能是由于对外源转基因的免疫原性，针对错配的人类组织相容性抗原(HLA)的反应性(无关/单倍体相合)，或针对次要组织相容性抗原(MiHA)(例如，HA-1、HA-2等)的反应性(相关/不相关的HLA匹配/单倍体相合)。应答也可以由供体T细胞介导，引起由针对错配的HLA/MiHA的反应性导致的GVHD，以及由针对肿瘤抗原/肿瘤相关的MiHA的反应性导致的抗肿瘤事件。为了防止对细胞疗法的宿主免疫反应性(例如，由错配的HLA或MiHA诱导的GVHD)，在一方面，本公开提供了经修饰的多能干细胞，其经工程化改造以消除内源性TCR表达。在一些实施方案中，通过TCRα和/或TCRβ(TRAC和/或TRBC1/TRBC2)的敲除(KO)来工程化改造内源性TCR的基因编辑。在一些实施方案中，通过RAG1/RAG2的KO来工程化改造细胞(取决于细胞来源和分化状态)。为了防止移植排斥，本公开提供了经修饰的多能干细胞，其经工程化改造以阻断供体HLA的表达和/或重新引入1HLAI类“非多态”等位基因以防止NK杀伤(例如单链HLA-E)。在一些实施方案中，对HLAI类分子(例如，B-2-微球蛋白、个别HLA分子(HLA-A，-B，-C，-E，-G)、TAP1，TAP2和/或与裸淋巴细胞综合症I(BLSI)相关的基因)进行修饰。在一些实施方案中，对HLAII类分子(例如，转录因子(RFXANK或RFX5或RFXAP)或反式激活因子(CIITA)，与BLSII相关的基因和/或个体HLA分子(HLA-DP、-DQ、-DR、-DM、-DO–α和β链))进行修饰。在一些实施方案中，进行修饰以促进肿瘤反应性(例如，引入肿瘤特异性TCR或CAR)。在一些实施方案中，进一步修饰细胞以消除抑制性受体(例如PDCD1，CTLA4)。在一些实施方案中，修饰细胞以引入共刺激受体(例如CD28，TNFRSF9)。在一方面，本公开提供了经修饰的多能干细胞，其经工程化改造以消除内源性TCR或HLA表达。在一些实施方案中，经修饰的多能干细胞包含缺陷的TCRα恒定区(TRAC)基因，缺陷的TCRβ恒定区(TRBC)基因或缺陷的β2微球蛋白(b2m)基因，任选地其中所述缺陷的基因是通过敲除产生的。在一些实施方案中，经修饰的多能干细胞包含缺陷的TCRα恒定区(TRAC)基因。在一些实施方案中，经修饰的多能干细胞包含缺陷的TCRβ恒定区(TRBC)基因。在一些实施方案中，经修饰的多能干细胞包含缺陷的β2微球蛋白(b2m)基因。在一些实施方案中，通过敲除产生缺陷基因。在一些实施方案中，缺陷的基因是使用CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、MegaTAL、大范围核酸酶、Cpf1、同源重组，或单链寡脱氧核苷酸(ssODN)进行编辑的。在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)编辑缺陷的基因。在一些实施方案中，所述细胞包含编码单链HLA三聚体的外源构建体，单链HLA三聚体包含与连接至稳定肽的β-2-微球蛋白连接的HLA，任选地，其中所述HLA三聚体为HLA-E、HLA-G，或HLA-E和HLA-G的组合；编码靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的外源构建体，任选地，其中所述肿瘤抗原选自肿瘤相关表面抗原，例如5T4、甲胎蛋白(AFP)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、BCMA、B-人绒毛膜促性腺激素、CA-125、癌胚抗原(CEA)、癌胚抗原(CEA)，CD123、CD133、CD138、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD4、CD40、CD44、CD56、CD70、CD8、CLL-1、c-Met、CMV-特异性抗原、CS-1、CSPG4、CTLA-4、DLL3、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、EBV-特异性抗原、EGFR变体III(EGFRvIII)、ELF2M、内皮糖蛋白、肝配蛋白B2、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、上皮肿瘤抗原、ErbB2(HER2/neu)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、FLT3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、神经胶质瘤相关抗原、鞘糖脂、gp36、HBV特异性抗原、HCV特异性抗原、HER1-HER2、HER2-HER3组合、HERV-K、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HPV特异性抗原、人端粒酶逆转录酶、IGFI受体、IGF-II、IL-11Rα、IL-13R-a2、流感病毒特异性抗原；CD38、胰岛素生长因子(IGFl)-l、肠道羧基酯酶、κ链、LAGA-la、λ链、拉沙病毒特异性抗原、凝集素反应性AFP、谱系特异性或组织特异性抗原，例如CD3、MAGE、MAGE-A1、主要组织相容性复合物(MHC)分子、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、M-CSF、黑色素瘤相关抗原、间皮素、间皮素、MN-CAIX、MUC-1、muthsp70-2、突变的p53、突变的p53、突变的ras、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.经修饰的多能干细胞，所述经修饰的多能干细胞经工程化改造以消除内源性TCR或HLA表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180216 US 62/710,591;20180518 US 62/673,6241.经修饰的多能干细胞，所述经修饰的多能干细胞经工程化改造以消除内源性TCR或HLA表达。


2.权利要求1的细胞，其包含缺陷的TCRα恒定区(TRAC)基因，缺陷的TCRβ恒定区(TRBC)基因或缺陷的β2微球蛋白(b2m)基因，任选地其中所述缺陷的基因是通过敲除产生的。


3.权利要求2的细胞，其中所述缺陷的基因是使用CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、MegaTAL、大范围核酸酶(meganuclease)、Cpf1、同源重组，或单链寡脱氧核苷酸(ssODN)进行编辑的。


4.权利要求1-3中任一项的细胞，包含：
编码单链HLA三聚体的外源构建体，单链HLA三聚体包含与连接至稳定肽的β-2-微球蛋白连接的HLA，任选地，其中所述HLA三聚体为HLA-E、HLA-G，或HLA-E和HLA-G的组合；
编码靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的外源构建体，任选地，其中所述肿瘤抗原选自肿瘤相关表面抗原，例如5T4、甲胎蛋白(AFP)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、BCMA、B-人绒毛膜促性腺激素、CA-125、癌胚抗原(CEA)、癌胚抗原(CEA)，CD123、CD133、CD138、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD4、CD40、CD44、CD56、CD70、CD8、CLL-1、c-Met、CMV-特异性抗原、CS-1、CSPG4、CTLA-4、DLL3、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、EBV-特异性抗原、EGFR变体III(EGFRvIII)、ELF2M、内皮糖蛋白、肝配蛋白B2、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、上皮肿瘤抗原、ErbB2(HER2/neu)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、FLT3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、神经胶质瘤相关抗原、鞘糖脂、gp36、HBV特异性抗原、HCV特异性抗原、HER1-HER2、HER2-HER3组合、HERV-K、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HPV特异性抗原、人端粒酶逆转录酶、IGFI受体、IGF-II、IL-11Rα、IL-13R-a2、流感病毒特异性抗原；CD38、胰岛素生长因子(IGFl)-l、肠道羧基酯酶、κ链、LAGA-la、λ链、拉沙病毒特异性抗原、凝集素反应性AFP、谱系特异性或组织特异性抗原例如CD3、MAGE、MAGE-A1、主要组织相容性复合物(MHC)分子、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、M-CSF、黑色素瘤相关抗原、间皮素、间皮素、MN-CAIX、MUC-1、muthsp70-2、突变的p53、突变的p53、突变的ras、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NKG2D、Nkp30、NY-ESO-1、p53、PAP、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、前列腺特异性抗原蛋白、STEAP1、STEAP2、PSMA、RAGE-1、ROR1、RU1、RU2(AS)、表面粘附分子、存活和端粒酶、TAG-72、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白C的Al结构域(TnCAl)、甲状腺球蛋白、肿瘤基质抗原、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、病毒特异性表面抗原，例如HIV特异性抗原(例如HIVgp120)，以及这些表面标志物的任何衍生物或变体；
编码TCR的外源构建体，任选地，其中所述TCR是α/βTCR、γ/δTCR、癌症或癌症相关抗原反应性TCR、针对鼠或其他非人类MHC具有反应性的TCR、I类或II类限制性TCR、识别HPV的TCR、病毒反应性TCR、EBVTCR、CMVTCR或流感TCR、HPV-16E6TCR、HPV-16E7TCR或MAGEA3/A6TCR或工程化改造的变体，或源自CD8、CD4、CD4/8双阳性、未成熟或发育中的T细胞、Treg、NKT或NKT细胞的TCR；和/或
编码自杀基因的外源构建体，其中所述自杀基因允许消除基因修饰的细胞，或用作非侵入式成...

【专利技术属性】
技术研发人员：EH格施温格，R吉恩，Y欧阳，A佩雷兹加西亚，M罗伯茨，R阿尔瓦雷兹罗德里格兹，D史密斯，X周，
申请(专利权)人：凯德药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US