检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种针对A组轮状病毒、诺如病毒II型的核酸适配体检测试剂盒，还提供了试剂盒的制备方法和应用。此试剂盒检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、有着良好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用
本申请涉及生物体外检测，具体地说，本专利技术涉及同时检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，制备试剂盒的方法，以及试剂盒在同时检测轮状病毒、诺如病毒样本中的应用。
技术介绍
轮状病毒(Rotavirus，RV)是一种双链核糖核酸病毒，隶属于呼肠孤病毒科，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，主要感染小肠上皮细胞，进而引起细胞损伤，导致腹泻。轮状病毒总共有七种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F和G，其中A组RV是导致全球5岁以下儿童严重脱水性腹泻的主要病原。由于在RV每次感染后人体的免疫力会逐渐的增强，所以成人很少会受到其影响。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，借由粪口途径传染，轮状病毒感染会导致严重的腹泻，造成婴儿与幼儿总计超过50％以上因为严重腹泻而住院治疗的案例，有时候甚至会因为脱水而导致死亡。对于轮状病毒A种传染病的专门诊断方式是对病患的粪便利用酶联免疫法识别病毒。逆转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)可以检测并识别所有种与所有血清型的人类轮状病毒。诺如病毒(Norovirus,NV)，又称诺瓦克病毒(NorwalkViruses,NV)是人类杯状病毒科中诺如病毒属的一种病毒。诺如病毒感染发病的主要表现为腹泻和/或呕吐，国际上通常称之为急性胃肠炎，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。诺如病毒分5个基因组(GⅠ～GⅤ)，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，我国目前最常见的诺如病毒为GⅡ、GⅠ型。诺如病毒传播途径包括人传人、经食物和经水传播。诺如病毒变异快、环境抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样、全人群普遍易感，具有高度传染性和快速传播的能力，血清抗体水平调查显示中国人群中诺如病毒感染的情况十分常见。对于检测诺如病毒GI群和GII群，Real-timeRT-PCR的敏感性高于传统RT-PCR。对于A组轮状病毒、诺如病毒II型的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。核酸适配体是一段单链核酸(一般大小在20～60个碱基左右)，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是适配子的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。目前市面上针对A组轮状病毒、诺如病毒II型的抗原检测试剂盒都是单通道检测，也就是一次反应只能检测一种抗原，无法做到同一个反应中对两种或两种以上病毒抗原的检测。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。婴幼儿腹泻仅是一种症状和表现形式，其病原体有时是单一的，但也有很大比例是混合感染，快速诊断显得尤为重要。目前市面上还没有此类检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同时快速检测轮状病毒、诺如病毒的试剂盒，使用该试剂盒可同时检测样本中是否存在轮状病毒、诺如病毒，灵敏度高，双通道同时快速检测。本专利技术的再一个目的是提供制备试剂盒的方法本专利技术的第三个目的是提供试剂盒在检测轮状病毒、诺如病毒样本中的应用。本专利技术公开了一种快速检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有轮状病毒的核酸适配体和诺如病毒II型的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。本专利技术还公开了核酸适配体的核苷酸序列，本专利技术中轮状病毒的核酸适配体具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，诺如病毒II型的核酸适配体具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术公开的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒中的组分A)固定样本溶液的蛋白包被板可采用普通的ELISA板包初上阳性或待检测样品，直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板。本专利技术继续公开了试剂盒的组成，其中B)蛋白包被液是由35mMNaHCO3，15mMNa2CO3,pH9.3-pH9.9组成的，其中C)封闭液是由136mMNaCl,2.6mMKCl,2mMKH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH7.1-pH7.7组成的，其中D)漂洗液是由136mMNaCl,2.6mMKCl,2mMKH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,pH7.1-pH7.7组成的，其中E)样本前处理液是由150mMNaCl,1％TritonX-100,50mMTris,pH7.8-pH8.2组成的。在一个优先方案中，本专利技术还公开了A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液是由35mMNaHCO3，15mMNa2CO3,pH9.6组成的，C)封闭液是由136mMNaCl,2.6mMKCl,2mMKH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH7.4组成的，D)漂洗液是由136mMNaCl,2.6mMKCl,2mMKH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,pH7.4组成的，E)样本前处理液是由150mMNaCl,1％TritonX-100,50mMTris,pH8.0组成的。本专利技术公开的核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。本专利技术还公开了制备检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒方法，轮状病毒的核酸适配体以A组轮状病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQIDNo.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；诺如病毒的核酸适配体以诺如病毒I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有轮状病毒的核酸适配体和诺如病毒II型的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有轮状病毒的核酸适配体和诺如病毒II型的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。


2.根据权利要求1所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于轮状病毒的核酸适配体具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，诺如病毒II型的核酸适配体具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mMNaHCO3，15mMNa2CO3,pH9.3-pH9.9组成的，C)封闭液是由136mMNaCl,2.6mMKCl,2mMKH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH7.1-pH7.7组成的，D)漂洗液是由136mMNaCl,2.6mMKCl,2mMKH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,pH7.1-pH7.7组成的，E)样本前处理液是由150mMNaCl,1％TritonX-100,50mMTris,pH7.8-pH8.2组成的。


4.根据权利要求3所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祺，刘为勇，刘芳，刘映乐，屈三甫，梅益，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42