一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法技术

一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法属于中药材鉴定技术领域。本发明专利技术以电喷雾串联质谱法(ESI‑MS/MS)为技术手段检测鹿茸鲜品和传统加工品各6批中的化学成分，通过ELISA法测定各样品促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量，利用化学计量法进行数据分析，利用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS‑DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS‑DA)方法相互关联，用以筛选出鹿茸促进睾丸间质细胞分泌睾酮的主要成分，保证了实验结果的准确性。该方法不仅能够为鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分研究提供依据，也为其他中药成分的研究提供了一定的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法
本专利技术属于中药材鉴定
，特别是涉及到一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法。
技术介绍
鹿茸(CerviCornuPantotrichum)是我国传统名药之一,为鹿科动物梅花鹿(CervusnipportTemminck)或马鹿(CervuselaphusLinnaeus)的雄鹿未骨化密生鸾毛的幼角。在我国有几千年的应用历史。味甘、咸，性温。归肾、肝经。始载于《神农本草经》列为中品，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等功效。睾丸间质细胞是一种存在于睾丸间质内部的内分泌细胞，主要功能是分泌睾酮，分泌的睾酮含量占睾酮总量的95％。改善雄激素的分泌量和调节生理机能是通过睾丸间质细胞分泌睾酮能力和增殖能力来表现的，故鹿茸的壮阳生精功效与机体睾酮水平密切相关。电喷雾电离串联质谱技术作为一种软电离技术，已成为研究天然产物结构的重要手段。直接进样电喷雾串联质谱法只需要很少的样品量，并且不需要对被分析物进行分离处理，节省了分析步骤，提高了检测效率。如能将其与化学计量学方法结合应用，就可将被分析中药等复杂体系中化学成分组成及结构与其对应活性相关联，从而达到快速筛选活性成分的目的。鹿茸的药效物质基础主要为多肽类成分，仅考察氨基酸，无法全面有效的筛选出鹿茸中促睾酮分泌的活性成分，所以本专利技术提出了一种以电喷雾串联质谱法(ESI-MS/MS)筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法,用于解决仅考察氨基酸，无法全面有效的筛选出鹿茸中促睾酮分泌的活性成分的技术问题。一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，步骤一、制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品；步骤二、制备鹿茸鲜品冻干粉以及鹿茸传统加工品样品冻干粉；步骤三、制备质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液；步骤四、对鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液分别进行电喷雾串联质谱测定，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱指纹谱图和鹿茸传统加工品滤液的一级质谱指纹谱图，将各图谱导出，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据；步骤五、分离培养活性测定用的大鼠睾丸间质细胞；步骤六、利用小鼠睾酮(T)试剂盒和显色后的吸光值分别测定鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量；步骤七、将所述步骤四获得的鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据用Excell表格整理并导入Simca-p14软件通过多元统计分析法获得鹿茸促进睾丸间质细胞分泌睾酮的潜在活性成分，并结合鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据获得鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分结构。所述步骤一中制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品的方法为：将新鲜鹿茸用酒精灯火燎，去除绒毛，切成2份，1份使用保鲜膜将其断面包裹，用于制备传统加工品样品，1份作为鲜鹿茸样品，将包裹好的鹿茸放入沸水中煮炸4次～8次，每次1min～3min，每次煮炸后用连有氮气的16号针头对茸尖端进行排血，最后一次煮炸排血后放入50℃～90℃的烘箱中烘烤6h～10h，取出切成小块，水洗4次～6次，保存于4℃的恒温冰箱中作为传统加工品备用。所述步骤二中制备鹿茸鲜品冻干粉以及鹿茸传统加工品样品冻干粉的方法为：分别取步骤一所得的鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品各10g～30g，分别以鹿茸样品质量10倍～20倍量的水进行组织粉碎，在4℃下浸提24h～36h，转速为3600r/min离心10min～30min后，取上清液进行微滤，将微滤液冻干，分别获得鹿茸鲜品冻干粉和鹿茸传统加工品冻干粉。所述步骤三中制备质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液的方法为：取步骤二中鹿茸鲜品冻干粉和鹿茸传统加工品冻干粉各1mg，分别以质量浓度60％～80％的甲醇溶解并定容至1ml，转速为12000r/min离心10min，取上清液，用0.45um的醇膜过滤，分别获得质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液。所述步骤三中电喷雾串联质谱测定使用的装置在实验前质量数经过校正确定质量范围为m/z:200～500，采用正离子模式，由流动注射泵进样，流速为5μL/min，干燥气温度为350℃，干燥气流量为9ml/min，雾化气压强为0.24Mpa(35.0psi)，毛细管电压为3.5kV。所述步骤五中分离培养活性测定用的大鼠睾丸间质细胞的方法为：取体重为250g～300g的SD雄性成年大鼠的睾丸并随机分组，分别放入TypeI胶原酶中，35℃～38℃恒温振荡器中振荡消化20min～40min，用2倍～4倍体积的DMEM培养基稀释终止消化，过滤、离心后制成悬浮液，将各悬浮液吸出后分别接种于培养瓶中，在37℃CO2孵箱中培养24h获得实验用睾丸间质细胞悬液；所述步骤六中测定鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量的方法为：以80μL/孔～120μL/孔将步骤五中培养后的密度为105个/mL细胞悬液接种在96孔板中，37℃、5％CO2条件下培养1天～2天后，将该96孔板分成供试品组、阳性组和空白对照组，向供试品组中分别加入供试品溶液100μL/孔，所述供试品溶液为鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液，分别获得加入鹿茸鲜品滤液的供试品组和加入鹿茸传统加工品滤液的供试品组，向阳性组中分别加入含人绒毛膜促性腺激素HCG终浓度为1U/mL的DMEM/F12培养液100μL/孔，向空白对照组分别加入DMEM/F12培养液100μL/孔，再将该96孔板在37℃、5％CO2条件下培养24h，分别吸取各组的细胞上清液用于进行小鼠睾酮(T)试剂盒实验，向预先包被有大鼠睾酮单克隆抗体的酶标板中分别加入不同浓度的小鼠睾酮(T)试剂盒中自带的标准品和样品，再分别加入生物素标记二抗和酶标试剂，在37℃条件下反应50min～80min形成免疫复合物，用洗涤液洗板4次～6次后除去未结合的酶，再分别依次加入小鼠睾酮(T)试剂盒自带的底物A和底物B，37℃条件下显色10min，再加入小鼠睾酮(T)试剂盒自带的终止液，在10min内测定450nm下的吸光值，并获得鹿茸鲜品和鹿茸传统加工品对睾丸间质细胞分泌含量。所述步骤七中的多元统计分析法包括主成分分析(PCA)法、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)法、偏最小二乘法判别分析法(PLS-DA)法和灰色关联度分析法(GRA)。所述步骤七中获得鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分结构的方法为：①将鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，/n步骤一、制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品；/n步骤二、制备鹿茸鲜品冻干粉以及鹿茸传统加工品样品冻干粉；/n步骤三、制备质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液；/n步骤四、对鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液分别进行电喷雾串联质谱测定，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱指纹谱图和鹿茸传统加工品滤液的一级质谱指纹谱图，将各图谱导出，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据；/n步骤五、分离培养活性测定用的大鼠睾丸间质细胞；/n步骤六、利用小鼠睾酮(T)试剂盒和显色后的吸光值分别测定鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量；/n步骤七、将所述步骤四获得的鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据用Excell表格整理并导入Simca-p14软件通过多元统计分析法获得鹿茸促进睾丸间质细胞分泌睾酮的潜在活性成分，并结合鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据获得鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分结构。/n...

【技术特征摘要】
1.一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，
步骤一、制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品；
步骤二、制备鹿茸鲜品冻干粉以及鹿茸传统加工品样品冻干粉；
步骤三、制备质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液；
步骤四、对鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液分别进行电喷雾串联质谱测定，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱指纹谱图和鹿茸传统加工品滤液的一级质谱指纹谱图，将各图谱导出，获得鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据；
步骤五、分离培养活性测定用的大鼠睾丸间质细胞；
步骤六、利用小鼠睾酮(T)试剂盒和显色后的吸光值分别测定鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液促进大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌量；
步骤七、将所述步骤四获得的鹿茸鲜品滤液的一级质谱数据、鹿茸传统加工品滤液的一级质谱数据、鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据用Excell表格整理并导入Simca-p14软件通过多元统计分析法获得鹿茸促进睾丸间质细胞分泌睾酮的潜在活性成分，并结合鹿茸鲜品滤液的离子峰二级质谱数据和鹿茸传统加工品滤液的离子峰二级质谱数据获得鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分结构。


2.根据权利要求1所述的一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：所述步骤一中制备鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品的方法为：
将新鲜鹿茸用酒精灯火燎，去除绒毛，切成2份，1份使用保鲜膜将其断面包裹，用于制备传统加工品样品，1份作为鲜鹿茸样品，
将包裹好的鹿茸放入沸水中煮炸4次～8次，每次1min～3min，每次煮炸后用连有氮气的16号针头对茸尖端进行排血，最后一次煮炸排血后放入50℃～90℃的烘箱中烘烤6h～10h，取出切成小块，水洗4次～6次，保存于4℃的恒温冰箱中作为传统加工品备用。


3.根据权利要求1所述的一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：所述步骤二中制备鹿茸鲜品冻干粉以及鹿茸传统加工品样品冻干粉的方法为：
分别取步骤一所得的鹿茸鲜品以及鹿茸传统加工品样品各10g～30g，分别以鹿茸样品质量10倍～20倍量的水进行组织粉碎，在4℃下浸提24h～36h，转速为3600r/min离心10min～30min后，取上清液进行微滤，将微滤液冻干，分别获得鹿茸鲜品冻干粉和鹿茸传统加工品冻干粉。


4.根据权利要求1所述的一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：所述步骤三中制备质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液的方法为：
取步骤二中鹿茸鲜品冻干粉和鹿茸传统加工品冻干粉各1mg，分别以质量浓度60％～80％的甲醇溶解并定容至1ml，转速为12000r/min离心10min，取上清液，用0.45um的醇膜过滤，分别获得质谱测定用的鹿茸鲜品滤液和鹿茸传统加工品滤液。


5.根据权利要求1所述的一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：所述步骤三中电喷雾串联质谱测定使用的装置在实验前质量数经过校正确定质量范围为m/z:200～500，采用正离子模式，由流动注射泵进样，流速为5μL/min，干燥气温度为350℃，干燥气流量为9ml/min，雾化气压强为0.24Mpa(35.0psi)，毛细管电压为3.5kV。


6.根据权利要求1所述的一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：所述步骤五中分离培养活性测定用的大鼠睾丸间质细胞的方法为：
取体重为250g～300g的SD雄性成年大鼠的睾丸并随机分组，分别放入TypeI胶原酶中，35℃～38℃恒温振荡器中振荡消化20min～40min，用2倍～4倍体积的DMEM培养基稀释终止消化，过滤、离心后制成悬浮液，将各悬浮液吸出后分别接种于培养瓶中，在37℃CO2孵箱中培养24h获得实验用睾丸间质细胞悬液。


7.根据权利要求1所述的一种筛选鹿茸促睾丸间质细胞分泌睾酮的活性成分的方法，其特征是：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，李春楠，王亚平，吴楠，杜延佳，李晶峰，李志成，边学峰，吕金朋，兰梦，高旭，
申请(专利权)人：吉林省东北亚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22