用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒，本研究基于基因组序列分析及保守序列的查找获得偶发分枝杆菌特异性较高的核酸序列，并开发基于环介导等温扩增技术检测目标菌株的核酸试剂盒，可在1h左右实现痰液样本到对偶发分枝杆菌检测的准确判读，相比于传统方法的鉴定有效缩短检测时间，操作方法更为简单便捷，检验人员无需经过复杂的培训过程，具有广泛和实际的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒
本专利技术涉及分子诊断
，更具体地，涉及用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸、引物及其试剂盒。
技术介绍
非结核分枝杆菌广泛分布于自然环境中，虽然对健康人无害，但是偶尔感染也表现出感染性而导致机体损伤，更多常见于HIV感染人群和免疫功能缺陷的人群。根据相关流行病学调查显示，NTM近年来临床的分离率也呈上升的趋势。进一步地，由非结核菌引起的疾病因菌的种类不用，治疗法也各有差异，所以确定其菌种也非常重要。然而由于非结核分枝杆菌没有特异的临床症状，所以依据临床表现、病理组织学等无法对非结核分枝杆菌的种类进行确定，因此对其诊断必须通过菌种鉴定。偶发分枝杆菌作为临床中分离率较高的非结核分枝杆菌之一，当前主要采用培养法结合生理生化实验培养出NTM，再通过hsp65，16SrRNA的PCR限制性片段分析的方法(PCR-RFLP)对偶发分枝杆菌进行鉴定。但此种方法无法实现从痰样到检测结果的直接判读，需要复杂的生理生化实验及精确的核酸测序技术，耗时较长(约40天)，费用昂贵，需要复杂的仪器及专业的技术人员。因此，急需要一种操作简单，耗时较短的方法对其进行鉴别。环介导等温扩增技术在由于特异性较高，操作简单快捷等优势已广泛应用于临床样本中结核分枝杆菌及其他致病菌的检测。然而由于对靶标序列要求较高，尚无利用此方法对偶发分枝杆菌特异性检测的报道。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本专利技术的首要目的是提供用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸。本专利技术的第二个目的是提供用于特异性检测偶发分枝杆菌的引物组。本专利技术的第三个目的是提供用于特异性检测偶发分枝杆菌的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现：用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术通过将Mycobacteriumfortuitum.(GenebankNO.CVRX01000283.1：22176-23693)的全基因组序列与其他亲缘物种[包括Mycobacteriumabscessus.(GenebankNO.NC_010397.1：1-1476)、Mycobacteriumasiaticum.(GenebankNO.NZ_HG964938.1：542012-543487)、Mycobacteriumavium.(GenebankNO.CP036220.1：5048733-5050267)、Mycobacteriumgordonae.(GenebankNO.NZ_LKTM01000337.1：18655-20157)、Mycobacteriumkansasii.(GenebankNO.NZ_CP019887.1：3158011-3159555)、Mycolicibacteriumphlei.(GenebankNO.NZ_CP014475.1：1-1485)、Mycobacteriumscrofulaceum.(GenebankNO.NZ_LZJW01000147.1：58754-60286)、Mycobacteriumshimoidei.(GenebankNO.UEGW01000001.1：1105578-1107077)、Mycobacteriumterrae.(GenebankNO.LT906469.1：1-1473)、Mycobacteroideschelonae.(GenebankNO.NZ_MLCH01000004.1：1005794-1007269)]的基因片段进行比对，发现SEQIDNO：1所示序列与其他亲缘物种的差异最大，因此推定其为可能的特异性检测位置。在获得特异性检测偶发分枝杆菌的核苷酸序列后，本专利技术针对该核苷酸序列设计并筛选获得能够特异性检测偶发分枝杆菌的引物组。因此，本专利技术还提供用于特异性检测偶发分枝杆菌的引物组，所述引物组包括内引物IF，IB，外引物OF，OB和环引物LF，LB；其核苷酸序列如SEQIDNO：2～7所示。本专利技术还提供基于环介导等温扩增技术用于特异性检测偶发分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒含有上述引物组。优选地，上述试剂盒还包括反应液、BstDNA聚合酶。更优选地，上述试剂盒还包括阴性对照，阳性对照，DNA提取液，密封液。具体地，上述反应液包含以下组分：Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween200.1％，甜菜碱0.8M，dNTP(each)1.4mM，引物OF/OB0.2μM，IF及IB各1.6μM，LF及LB各0.8μM，1×SYTO9染料。具体地，所述阳性对照为含有如SEQIDNO.1序列的核苷酸质粒或为偶发分枝杆菌提取的核酸基因组；所述阴性对照为超纯水。优选地，上述试剂盒的反应体系(25μL)为：反应液22μL，BstDNA聚合酶(8U)1.0μL，加入核酸模板为2μL。优选地，上述试剂盒的反应程序为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBRGreen通道)，60个循环。优选地，上述DNA提取液的组分为：20mMTris-Base，2mMEDTA，1.2％TritonX-100。本专利技术还提供利用上述试剂盒进行检测样本中偶发分枝杆菌的方法，包括以下步骤：S1、样本处理：在样本处理室进行，在痰样中加入3倍体积的4％的NaOH溶液，旋涡震荡均匀，室温下放置15min，然后吸取1mL加入带旋盖的离心管中。12000rpm离心5min，去上清液。加入0.9％的NaCl或生理盐水1mL，混匀，12000rpm离心5min，去上清液。加入100μL的DNA提取液，100℃加热10min，加热后立即冷却10min，12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，上清液即为恒温扩增的DNA模板；若是菌液样本经高速离心后加入DNA提取液，按照上述步骤进行操作，获得上清液即为待测样本的核酸模板。S2、准备反应体系：反应液22μL，BstDNA聚合酶(8U)1.0μL，加入核酸模板为2μL；S3、核酸扩增：放置在实时荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用如下程序，具体为：第一步：63℃反应30s；第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号(SYBRGreen通道)，60个循环。S4、结果判定：出现阳性对照特异性扩增，阴性对照无非特异性扩增，即为阳性；反之则为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本研究基于基因组序列分析及保守序列的查找获得偶发分枝杆菌特异性较高的核酸序列，并开发基于环介导等温扩增技术检测目标菌株的核酸试剂盒，可在1h左右实现痰液样本到对偶发分枝杆菌检测的准确判读，相比于传统方法的鉴定有效缩短检测时间，操作方法更为简单便捷，检验人员无需经过复杂的培训过程，具有广泛和实际的应用推广价值。附图说明图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的序列如SEQID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测偶发分枝杆菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的序列如SEQIDNO：1所示。


2.用于特异性检测偶发分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括内引物IF，IB，外引物OF，OB和环引物LF，LB；其核苷酸序列如SEQIDNO：2～7所示。


3.基于环介导等温扩增技术用于特异性检测偶发分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的引物组。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液、BstDNA聚合酶。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，阳性对照，DNA提取液，密封液。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有如SEQIDNO.1序列的核苷酸质粒或为偶发分枝杆菌提取的核酸基因组；所述阴性对照为超纯水。


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【专利技术属性】
技术研发人员：徐行勇，陈皇佑，申洪杰，
申请(专利权)人：广州迪澳生物科技有限公司，广州迪澳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44