本发明专利技术公开了一种未知的新piRNA ND9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。未知piRNA ND9作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。检测ND5表达量的试剂在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。本发明专利技术通过研究发现piRNA ND9在肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤的肿瘤组织与正常组织中的表达差异显著，可以做为区分胚胎性恶性肿瘤与正常组织的潜在标志物。
【技术实现步骤摘要】
一种piRNAND9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂
本专利技术属于生物检测领域，涉及一种piRNAND9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂，具体是piRNAND9(TCTCGTGATGAAAACTCTGTCCAGT)作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。
技术介绍
肿瘤干细胞(CSC)理论认为，CSCs是肿瘤复发转移及抵抗放化疗的根本原因。了解肿瘤干细胞的起源以及发生过程则有助于我们更好的判断肿瘤的预后以及更精准的进行靶向治疗。课题组前期用Piwil2重编程正常FB细胞建立了稳定表达Piwil2-GFP标记的肿瘤干细胞(Piwil2-iCSC)，并经过了细胞生物行为学测试以及肿瘤干细胞标志物检测证实重编程成功，可以作为理想的体外CSCs细胞模型。piRNA是一段长度为23-31nt的sncRNA，特征是在5’端常见单磷酸的尿嘧啶核糖核酸，而在3′末端有甲基化修饰[8]。其作用机制主要是结合PIWI蛋白(Piwil2/Piwil4)，通过乒乓效应抑制转座子的功能起到稳定基因的作用，此外piRNA还可通过DNA甲基化与组蛋白修饰参与基因调节。通过Piwil2重编程成纤维细胞形成体外CSCs模型，我们推测Piwil2基因过表达所致的相关piRNA的表达量及功能发生的变化可能是在肿瘤发生过程中具有的重要作用，其差异表达的piRNA可能对肿瘤组织的发生以及对肿瘤的诊治及预后判断有重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种piRNAND9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。本专利技术的另一目的是提供一种ND5作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：ND5作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。检测ND5表达量的试剂在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。一种ND5作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂，其特征在于包含检测ND5表达量的试剂。有益效果：本专利技术通过研究发现未知piRNAND9在肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤的肿瘤组织与正常组织中的表达差异显著，可以做为区分胚胎性恶性肿瘤与正常组织的潜在标志物，检测上述piRNA的试剂可用于制备儿童肾母细胞瘤神经母细胞瘤，肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂。附图说明图1表达差异显著的piRNA的预测靶基因的GO分析图2差异piRNA的预测靶基因的蛋白互作分析(a：蛋白互作网络；b：蛋白互作综合评分；c：蛋白互作点数)图3piRNANU9,NU13,ND5,ND7,ND9及其靶基因NOP56,RPS8，MTRNR2L1在肾母细胞瘤组织中的表达情况具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步说明。NU9序列:TCTCGTGATGAAAACTCTGTCCAGT(SEQIDNO.1)NU13序列:TGGAGGTGATGAACTGTCTGAGCCTGACCTT(SEQIDNO.2)ND5序列:ATGTTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGC(SEQIDNO.3)ND7序列:ATGTTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGCC(SEQIDNO.4)ND9序列:TTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGCC(SEQIDNO.5)1标本与材料1.1主要试剂及仪器CO2孵箱(美国Thermo公司)、恒温水浴箱(上海医疗器械厂)细胞培皿(美国Hyclone公司)、移液器(德国Eppendorf公司)、超速离心机(美国Thermo公司)荧光显微镜(日本Nikon公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、F-12培养基(美国Gibico公司)、嘌呤霉素(美国Sigma公司)、Trizol(美国Thermo公司)、miRNA逆转录第一链试剂盒(中国天根TIANGEN公司)、miRNA荧光定量PCR试剂盒(中国天根TIANGEN公司)、mRNA逆转录第一链试剂盒(日本Takara公司)、mRNA荧光定量PCR试剂盒(德国Qiagen公司)1.2细胞课题组前期将携带Piwil2-GFP标记的慢病毒以及空载目的基因的GFP标记的慢病毒分别转染原代培养的小儿包皮成纤维细胞(FB)，经细胞行为学及体外细胞染色体核型分析证实成功构建Piwil2诱导的肿瘤干细胞，并长期储存于液氮中。1.3临床标本收集重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科2015年6月至2019年6月入院肾母细胞瘤患者的手术标本，均为首次行肿瘤切除术并经病理科2位医师证实为肾母细胞瘤组织。标本来自34例儿童，男15例，女19例，平均年龄29.9(4.0～104.0·)个月，依照美国国家肾母细胞瘤研究组(NWTS-5)标准，组织分化良好型(FH)27例，分化不良型(uFH)7例，分期I期7例，II期9例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例，Ⅴ期6例。每位患者皆取其肿瘤组织作为肿瘤组，并取其癌旁组织距离肿瘤≥3cm正常肾脏组织作为对照组织，Ⅴ期双侧肿瘤则取肿瘤同侧的正常肾脏组织。2实验方法2.1细胞培养将Piwil2-FB、GFP-FB细胞从-80℃冰箱中取出，快速在37℃水浴箱中复温，将细胞悬液移至10mlEP管中，加入2mlF12培养基后离心清洗后分别培养于10％胎牛血清的F12培养基(10cm的培养皿)，在37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞每隔48小时进行换液，待细胞生长至80％融合度以上时使用trizol消化进行总RNA提取。2.2总RNA提取、逆转录及qPCRtrizol法提取细胞及组织的总RNA，将10cm培养皿中细胞用1mltrizol消化10min后吸入1.5ml去酶EP管中(组织加100μg/mltrizol后电动匀浆器充分匀浆1-2分钟)，加入200μl氯仿震荡混匀后室温放置15分钟，4℃12000g离心15分钟，吸取上清加入500μl异丙醇混匀室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟，弃上清，加入1ml75％乙醇温和震荡，4℃8000g离心5分钟弃上清，真空干燥5-10分钟后加入50μlDEPC水溶解。进行NanoDropND-1000分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳进行质量检验，满足标准A260/A280在1.8～2.0之间且电泳可见28s、18s两条亮带。使用miRNA逆转录试剂盒(天根TIANGEN)以及mRNA逆转录试剂盒(Takara)将总RNA逆转录为cDNA。qPCR引物设计来自上海生工(表1)，qPCR实验步骤参见miRNA荧光定量试剂盒(天根TIANGEN)和mRNA荧光定量试剂盒(Qiagen)。表12.3二代测序及靶基因预测送检2组样本(Piwil2-FB、GFP-FB)于上海惠研生物进行二代测序。通过illuminaHiseq2000测序平台的单端50bp测序模式对模式物种人类本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.piRNA ND9作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.piRNAND9作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。
2.检测ND5表达量的试剂在制备儿童肾母细胞瘤、...
【专利技术属性】
技术研发人员：何大维，王璋，
申请(专利权)人：何大维，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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