一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法，属于核酸检测技术领域，该核酸免提取试剂是由海藻糖、PEG8000、Tris‑HCl、EDTA、Triton X‑100及核酸释放剂组成的混合液体；本发明专利技术通过Triton X‑100和核酸释放剂的协同作用，能够高效裂解病原微生物，快速释放其中的DNA或RNA。一方面，通过EDTA能够鳌和金属离子，降低DNase和RNase的酶活，另一方面，通过海藻糖和PEG8000在RNA和DNA表面形成保护层，使其能够在溶液中稳定存在。最后通过Tris稳定该试剂的pH，以确保RNA或DNA均可稳定保存。通过上述组份的协同作用，本发明专利技术的核酸免提取试剂能够在室温条件下直接完成核酸的释放，避免了加热、离心、洗涤等繁琐操作，所得产物可以直接用于PCR扩增。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法
本专利技术属于核酸检测
，涉及一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法。
技术介绍
基于PCR技术进行病原微生物检测具有特异性好、灵敏度高、简单快速的特点。其中，病原微生物核酸提取质量的高低是下游所有核酸检测的关键，所得核酸质量将直接影响研究或诊断结果。但是，传统的核酸提取方法，包括柱提取法、磁珠法等，均需要进行十分繁琐的裂解、多次洗涤、洗脱等过程，不仅耗时长，而且容易交叉污染。同时，在核酸提取过程中很容易造成核酸的大量丢失，尤其在微量样品的核酸提取过程中核酸的丢失比例更高，甚至导致漏检的发生。当检测样品为RNA病毒时，较长的提取过程也容易造成RNA的降解。这些因素对核酸检测结果的准确性造成了极大影响。中国专利200910309980.2公开了一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法，针对待测病原菌管家基因，设计特异性引物，采用核酸快速释放剂提取病原体核酸，然后直接用于PCR扩增，实现PCR荧光定量检测，该方法操作简单快速，抗污染干扰能力强，提取的核酸无损失。但是，该核酸释放剂中含有一定量的SDS、Surfactin等，对PCR扩增存在较为严重的抑制作用。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种核酸免提取试剂，是由海藻糖、PEG8000、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100及核酸释放剂组成的混合液体；其中，海藻糖的浓度为0.1～1M，Tris-HCl的浓度为1～10mM，EDTA的浓度为0.1～5mM；PEG8000占混合液体总质量的0.1％～2％，TritonX-100占混合液体总质量的0.1％～1％，核酸释放剂占混合液体总质量的0.001％～0.1％。优选地，该核酸免提取试剂的pH值为6.5～7.5。优选地，该核酸免提取试剂在-80℃～100℃能够稳定存在。优选地，所述核酸释放剂采用十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵。本专利技术还公开了上述的核酸免提取试剂的使用方法，将所述核酸免提取试剂与样品混匀，室温放置1-10min，然后取1-10μl作为模板进行核酸检测。优选地，核酸检测选择PCR法、荧光定量PCR法、环介导等温扩增法或重组酶聚合酶扩增法。本专利技术还公开了上述的核酸免提取试剂作为核酸检测试剂的应用。优选地，所述核酸检测试剂用于检测口腔拭子、唾液、血清、脑脊液、生殖道分泌物或尿液。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开的核酸免提取试剂，通过TritonX-100和核酸释放剂的协同作用，能够高效裂解病原微生物，快速释放其中的DNA或RNA。一方面，通过EDTA能够鳌和金属离子，降低DNase和RNase的酶活，另一方面，通过海藻糖和PEG8000在RNA和DNA表面形成保护层，使其能够在溶液中稳定存在。最后通过Tris稳定该试剂的pH，以确保RNA或DNA均可稳定保存。通过上述组份的协同作用，本专利技术的核酸免提取试剂能够在室温条件下直接完成核酸的释放，避免了加热、离心、洗涤等繁琐操作，所得产物可以直接用于PCR扩增。进一步地，本专利技术核酸免提取试剂的热稳定性高，可以在-80℃低温和100℃高温条件下稳定存在。进一步地，本专利技术的核酸酸释放剂可以是十二烷基二甲基苄基氯化铵(又名苯扎氯铵，DDBAC)或十二烷基二甲基苄基溴化铵(又名苯扎溴铵)。通过TritonX-100和十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵协同作用下，能够高效裂解病原微生物，快速释放其中的DNA或RNA。本专利技术公开的上述核酸免提取试剂的检测方法，只需将上述核酸免提取试剂与样品混匀，室温放置1-10min，然后取1-10μl作为模板进行核酸检测即可，该方法不同于传统的核酸提取试剂盒需要对样品进行裂解、洗涤、洗脱等繁琐的操作，大大简化了检验流程，降低了可能存在的交叉污染和院内感染的风险。传统的病原微生物核酸提取需要进行繁琐的纯化步骤，而本专利技术的核酸免提取试剂可以在常温10min内完成模板制备。同时，该方法的使用使得病原微生物的核酸检测更加方便、快速、精准。本专利技术核酸免提取试剂的适用性广，可以适应口腔拭子、唾液、血清、脑脊液、生殖道分泌物、尿液等多种样品。附图说明图1为不同方法处理高浓度样品后的扩增结果；图2为不同方法处理低浓度Escherichiacoli16SrRNA后的扩增结果；图3为不同方法处理低浓度Escherichiacoli16SrRNA(耐高温)后的扩增结果；图4为不同方法处理唾液中高浓度样品后的扩增结果；图5为不同方法处理血清中高浓度样品后的扩增结果；图6为不同方法处理脑脊液中高浓度样品后的扩增结果；图7为不同方法处理尿液中高浓度样品后的扩增结果；图8为不同方法处理金黄色葡萄球菌后的扩增结果；图9为不同方法处理隐球菌后的扩增结果；图10为不同方法处理慢病毒后的扩增结果；图11不同方法处理慢病毒后的LAMP扩增结果。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本专利技术的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。下面结合附图对本专利技术做进一步详细描述：本专利技术的核酸免提取试剂，包含0.1-1M海藻糖，0.1-2％PEG8000，1-10mMTris-HCl(pH6.5-7.5)，0.1-5mMEDTA，0.1-1％TritonX-100，0.001-0.1％核酸释放剂。其中的核酸释放剂可以是十二烷基二甲基苄基氯化铵(又名苯扎氯铵)或十二烷基二甲基苄基溴化铵(又名苯扎溴铵)。所述核酸释放剂能够与TritonX-100共同作用，在极低的浓度下有效裂解病原微生物并释放核酸，该核酸释放剂的工作浓度极低，对PCR、RT-PCR、LAMP、RPA等核酸扩增技术均无干扰作用。其中的Tris-HCl(pH6.5-7.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸免提取试剂，其特征在于，是由海藻糖、PEG8000、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100及核酸释放剂组成的混合液体；/n其中，海藻糖的浓度为0.1～1M，Tris-HCl的浓度为1～10mM，EDTA的浓度为0.1～5mM；PEG8000占混合液体总质量的0.1％～2％，Triton X-100占混合液体总质量的0.1％～1％，核酸释放剂占混合液体总质量的0.001％～0.1％。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸免提取试剂，其特征在于，是由海藻糖、PEG8000、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100及核酸释放剂组成的混合液体；
其中，海藻糖的浓度为0.1～1M，Tris-HCl的浓度为1～10mM，EDTA的浓度为0.1～5mM；PEG8000占混合液体总质量的0.1％～2％，TritonX-100占混合液体总质量的0.1％～1％，核酸释放剂占混合液体总质量的0.001％～0.1％。


2.根据权利要求1所述的核酸免提取试剂，其特征在于，该核酸免提取试剂的pH值为6.5～7.5。


3.根据权利要求1所述的核酸免提取试剂，其特征在于，该核酸免提取试剂在-80℃～100℃能够稳定存在。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫亚平，张鑫，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61