一种基因治疗载体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种基因治疗载体及其用途，该基因治疗载体包括：a)左(5′)LTR；b)Psi(ψ)包装信号；c)逆转录病毒输出元件；d)中心多嘌呤区/中央终止序列；e)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子；f)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸；g)转录后调控元件；以及h)右(3′)LTR。该基因治疗载体能够体外改造细胞，使细胞表达CSF1R蛋白，从而治疗HDLS，改善HDLS患者的生存状态。

【技术实现步骤摘要】
一种基因治疗载体及其用途
本专利技术涉及基因治疗
，尤其涉及一种基因治疗载体及其用途。
技术介绍
遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变(HDLS，hereditarydiffuseleukoencephalopathywithspheroids)由瑞典医生在1984年首次描述。临床表现包括认知障碍(记忆力下降、言语障碍等)，人格行为改变(抑郁、淡漠、焦虑、易激怒等)，运动功能障碍(行走困难、行动失调、共济失调等)，容易误诊为艾尔兹海默病、额颞叶痴呆、帕金森综合征、多发性硬化及脑白质病。发病年龄为47.2±14.5岁，平均病程6.0±3.1年，死亡年龄为57.2±13.1岁。病理表现为额叶、额顶叶萎缩，脑室扩张，脑白质变形，可观察到髓鞘、轴突丢失以及大量的轴索球样变。目前临床尚无有效的HDLS治疗方法，一般以对症治疗为主，主要包括一般护理、营养支持、抗痫药物及抗生素使用。而对症治疗的方法并不能根治疾病，只能轻微缓解患者症状。因此，急需新的治疗方法以改善HDLS患者的生存状态。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提出一种基因治疗载体及其用途，该基因治疗载体能够体外改造细胞，使细胞表达集落刺激因子1受体(CSF1R)蛋白，从而治疗HDLS，改善HDLS患者的生存状态。基于上述目的，本专利技术的第一个方面提供了一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗HDLS，其包括：a)左(5′)LTR；b)Psi(ψ)包装信号；c)逆转录病毒输出元件；d)中心多嘌呤区/中央终止序列；e)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子；f)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸；g)转录后调控元件；以及h)右(3′)LTR。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述基因治疗载体可以是γ逆转录病毒载体、腺关联病毒(AAV)载体、腺病毒载体或疱疹病毒载体；优选地，所述基因治疗载体为慢病毒载体。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述慢病毒选自以下：人类免疫缺陷病毒(HIV)、维斯纳-梅迪病毒(VMV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)；优选地，所述慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，上述基因治疗载体还包括编码表达标签的核苷酸序列；优选地，所述表达标签为截短的表皮生长因子受体、萤火虫荧光素酶、增强的绿色荧光蛋白、链霉亲和素结合肽标签(StreptagII)或Flag标签(Flagtag)。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述左(5′)LTR的启动子由选自以下的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述右(3′)LTR包括一个或多个修饰；优选地，所述右(3′)LTR包括防止病毒转录超出第一轮病毒复制的一个或多个缺失；更优选地，所述右(3′)LTR包括3′LTR的U3区域中TATA框以及Sp1和NF-κB转录因子结合位点的缺失；进一步优选地，所述右(3′)LTR是自身失活(SIN)LTR。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子包括：短延伸因子1α(EF1α)启动子或其转录活性片段、骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区域缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或其转录活性片段；优选地，所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子选自以下：跨膜蛋白119(TMEM119)、整合素亚单元αM(CD11b)、CD45、离子钙结合衔接分子1(IBA1)、C-X3-C基序趋化因子受体1(CX3CR1)、粘附G蛋白偶联受体E1(F4/80)、CD68或CD40。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述集落刺激因子1受体多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；优选地，所述编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸是经过密码子优化的表达序列，如SEQIDNO：4所示。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述基因治疗载体分别为pMND-CSF1R-LV或pEF1α-CSF1R-LV，所述pMND-CSF1R-LV的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述pEF1α-CSF1R-LV的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。基于相同的专利技术构思，本专利技术的第二个方面提供了一种用基因治疗载体转导的细胞，其包括上述的基因治疗载体。在本专利技术的优选的实施方案中，其中，所述细胞包括造血干细胞、干细胞或祖细胞；优选地，所述细胞为CD34+细胞。基于相同的专利技术构思，本专利技术的第三个方面提供了一种药物组合物，其包括上述的基因治疗载体或上述的细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。基于相同的专利技术构思，本专利技术的第四个方面提供了上述的基因治疗载体、上述的细胞或上述的药物组合物在制备预防、治疗和减轻遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变(HDLS)及相关疾病的药物中的用途；以及上述的基因治疗载体、上述的细胞或上述的药物组合物在制备减少或消除集落刺激因子1受体(CSF1R)表达的集落刺激因子1受体(CSF1R)基因突变的药物中的用途。附图说明图1为不同启动子的CSF1R蛋白表达载体示意图；其中上方的图对应pMND-CSF1R-LV载体(MND启动子)的结构示意图，下方的图对应于pEF1α-CSF1R-LV载体(EF1α-短启动子)的结构示意图；图2为考马斯亮蓝染色检测造血干细胞中CSF1R蛋白表达的染色结果图；图3为流式检测造血干细胞(用pMND-CSF1R-LV载体转导)中CSF1R蛋白表达；图4为流式检测造血干细胞(用pEF1α-CSF1R-LV载体转导)中CSF1R蛋白表达；图5为流式检测分化后的巨噬细胞中CSF1R蛋白表达。具体实施方式需要说明的是，除非另外定义，本说明书一个或多个实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。通过本专利技术提供的序列信息，本领域技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的载体。“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂交体。“患者”是指已经诊断患有可以用基因治疗载体、基于细胞的疗法和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因治疗载体，其包括：/na)左(5′)LTR；/nb)Psi(ψ)包装信号；/nc)逆转录病毒输出元件；/nd)中心多嘌呤区/中央终止序列；/ne)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子；/nf)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸；/ng)转录后调控元件；以及/nh)右(3′)LTR。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因治疗载体，其包括：
a)左(5′)LTR；
b)Psi(ψ)包装信号；
c)逆转录病毒输出元件；
d)中心多嘌呤区/中央终止序列；
e)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子；
f)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸；
g)转录后调控元件；以及
h)右(3′)LTR。


2.根据权利要求1所述的基因治疗载体，其中，所述基因治疗载体为γ逆转录病毒载体、腺关联病毒载体、腺病毒载体或疱疹病毒载体；
优选地，所述基因治疗载体为慢病毒载体。


3.根据权利要求2所述的基因治疗载体，其中，所述慢病毒选自以下：人类免疫缺陷病毒、维斯纳-梅迪病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒或猿猴免疫缺陷病毒；
优选地，所述慢病毒为人类免疫缺陷病毒。


4.根据权利要求1-3之一所述的基因治疗载体，其中，还包括编码表达标签的核苷酸序列；
优选地，所述表达标签为截短的表皮生长因子受体、萤火虫荧光素酶、增强的绿色荧光蛋白、链霉亲和素结合肽标签或Flag标签。


5.根据权利要求1-4之一所述的基因治疗载体，其中，所述左(5′)LTR的启动子由选自以下的异源启动子替换：巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子或猿猴病毒40启动子。


6.根据权利要求1-5之一所述的基因治疗载体，其中，所述右(3′)LTR包括一个或多个修饰；
优选地，所述右(3′)LTR包括防止病毒转录超出第一轮病毒复制的一个或多个缺失；
更优选地，所述右(3′)LTR包括3′LTR的U3区域中TATA框以及Sp1和NF-κB转录因子结合位点的缺失；
进一步优选地，所述右(3′)LTR是自身失活(SIN)LTR。


7.根据权利要求1-6之一所述的基因治疗载体，其中，所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子包括：短延伸因子1α启动子或其转录活性片段、骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区域缺失并且dl587rev引物结合位点取代的启动子或其转录活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁薪安，何霆，齐菲菲，刘光华，胡雪莲，
申请(专利权)人：北京艺妙神州医药科技有限公司，北京艺妙医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11