一种治疗肝纤维化的siRNA及其递送制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种小干扰RNA，其通过NOX1 siRNA进行RNA干扰（RNAi），可以有效靶向NOX1蛋白，抑制活性氧（ROS）的产生，有效抑制肝星状细胞（HSC）的活化，进而起到治疗肝纤维化的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗肝纤维化的siRNA及其递送制剂
本专利技术涉及医药制剂领域，具体涉及一种治疗肝纤维化的siRNA及其递送制剂。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。长度为20-25nt的siRNA(SmallinterferingRNA，小干扰核酸)能够引发RNAi，可以特异性下调或关闭特定基因的表达，并具备的高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。肝纤维化是肝损伤的结果，是各种致病因子所导致的肝内结缔组织异常增生，肝纤维化可能导致肝功能障碍，是肝损伤发展成其他慢性疾病的主要过程。其特征在于响应于慢性损伤的炎症细胞的募集和肝星形细胞(HSC)的活化，引起细胞外基质的积聚。脂肪变性(steatosis)通常与肝炎和肝细胞损伤共存。不论其病因如何，增加的氧化应激是在所有慢性肝病中引起纤维化的常见因素。受损的肝细胞、HSC和浸润的炎症细胞是活性氧簇(ROS)的主要来源。实际上，氧化应激将诱导炎症细胞的募集和HSC的活化。因此，在慢性肝损伤背景下，将会发生肝细胞损伤、ROS产生、HSC活化和炎症细胞募集的恶性循环，从而放大对损伤的纤维化应答。近年来，抗肝纤维化药物的研发及治疗在肝纤维化的不同靶点、抑制肝星状细胞活化与增殖、增强基质金属蛋白酶活性及抑制金属蛋白酶组织抑制剂的活性、抑制炎症反应、调节免疫反应的药物，以及纳米颗粒与抗纤维化药物结合的治疗和基因治疗方面取得了显著的进展。但目前还没有有效针对肝纤维化的治疗方法。传统药物可能存在由于给药剂量大等因素导致的不良反应，而基因治疗由于高效、靶向性强、易操作等特点成为未来抗肝纤维化不可或缺的研究方向。活性氧(ROS)可以通过HSC中的氧化还原敏感蛋白激酶和转录因子来调节各种介体的激活和表达。NADPH氧化酶是吞噬细胞中ROS的主要来源，具有关键作用。NOX是NADPH氧化酶的催化亚基，NOX1是一种NOX的亚型，能够产生ROS。在肝纤维化的形成过程中，各种致病因素持续作用于肝星状细胞(HSC)，使其活化增殖、凋亡减少，进而使胶原蛋白合成增加，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度沉积。故若能有效抑制HSC的活化增殖，即可有效阻止肝纤维化的发生及进一步发展。活性氧在肝纤维化形成过程中具有重要意义，其NADPH氧化酶(NOX)主要通过活化HSC而发挥作用。有研究表明，在肝纤维化大鼠及肝硬化患者中NOX1表达增加，研究进一步表明NOX1可能将成为一种新的肝纤维化的治疗靶点(Lan,Kisselevaetal.2015)。肝星状细胞(HSC)位于肝窦间隙，约占肝脏细胞总数的10％，一般药物只能进入肝细胞而很少能进入肝窦间隙，更难进入肝星状细胞(HSC)，因此靶向肝星状细胞(HSC)的药物很少。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人意外的发现，通过NOX1siRNA进行RNA干扰(RNAi)，可以有效靶向NOX1蛋白，抑制活性氧(ROS)的产生，有效抑制肝星状细胞(HSC)的活化，进而起到治疗肝纤维化的作用。本专利技术的技术方案为，一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其由正义链和与其反向互补的反义链组成，所述正义链具有5’-GAGAUGUGGGAUGAUCGUGACTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-GUCACGAUCAUCCCACAUCUCTT-3’的核苷酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。进一步地，所述小干扰RNA，其中，所述正义链和反义链上分别自5’端起的前21个核苷酸任选地进行2’-O-核糖修饰，所述2’-O-核糖修饰选自2’-O-核糖甲基修饰、2’-O-核糖氟代修饰和2’-O-MOE核糖修饰。本专利技术的另一技术方案为，一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其由正义链和与其反向互补的反义链组成：所述正义链具有5’-CAAGCUGGUGGCCUAUAUGAUTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-AUCAUAUAGGCCACCAGCUUGTT-3’的反义核酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。进一步地，所述小干扰RNA，其中，所述正义链和反义链上分别自5’端起的前21个核苷酸任选地进行2’-O-核糖修饰，所述2’-O-核糖修饰选自2’-O-核糖甲基修饰、2’-O-核糖氟代修饰和2’-O-MOE核糖修饰。本专利技术的另一目的为提供一种有效的小干扰RNA递送制剂。本专利技术提供如下技术方案：一种递送制剂，其包含本专利技术所述的小干扰RNA和包载小干扰RNA的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺聚合物。进一步地，本专利技术所述的递送制剂，其中，所述聚乙烯亚胺聚合物的分子式为分子量为40000-52000Da，其中，n的数值根据分子量确定。进一步地，本专利技术所述的递送制剂，其中，所述聚乙烯亚胺聚合物为法国Polyplus的辅料invivo-jetPEI。进一步地，本专利技术所述的递送制剂，其包含小干扰RNA，聚乙烯亚胺聚合物和溶剂，其中，小干扰RNA：聚乙烯亚胺聚合物：溶剂的比例为1g：0.1～0.2L：50-150L。优选地，本专利技术所述的递送制剂，其中，所述小干扰RNA：聚乙烯亚胺聚合物：溶剂的比例为1g：0.16L：80-120L。优选地，本专利技术所述的递送制剂，其中，所述溶剂为5％的葡萄糖水溶液。本专利技术还提供所述小干扰RNA和递送制剂的治疗用途。作为本专利技术的一种方案，本专利技术还提供所述小干扰RNA和递送制剂在制备用于治疗肝损伤或肝纤维化的药物中的用途。作为本专利技术的另一方案，本专利技术还提供所述小干扰RNA和递送制剂在制备降低肝脏中NOX1mRNA的表达水平的药物中的用途。本专利技术能实现的技术效果为，针对目前尚无有效的治疗急性肝损伤和肝纤维化的手段，通过深入的研究，筛选并分离出了两条小干扰RNA序列，可以有效的降低肝脏中NOX1mRNA的表达水平，试验证明，可以在四氯化碳诱导的急性肝损伤和慢性肝纤维化模型起到治疗作用，本专利技术还利用采购自法国Polyplus公司的阳离子聚合物invivojetPEI包载针对NOX1的siRNA，达到良好的递送效果，在实验过程中，尚未发现明显的毒性。附图说明图1NOX1siRNA1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的ALT的影响；图2NOX1siRNA1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的AST的影响；图3NOX1siRNA1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的TBIL的影响；图4NOX1siRNA1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的肝脏HE切片的影响；图5NOX1siRNA2对CCL4诱导的慢性肝纤维化模型小鼠的ALT的影响；图6NOX1siRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其特征在于：由正义链和与其反向互补的反义链组成，所述正义链具有5’-GAGAUGUGGGAUGAUCGUGACTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-GUCACGAUCAUCCCACAUCUCTT-3’的核苷酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其特征在于：由正义链和与其反向互补的反义链组成，所述正义链具有5’-GAGAUGUGGGAUGAUCGUGACTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-GUCACGAUCAUCCCACAUCUCTT-3’的核苷酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。


2.根据权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于：所述正义链和反义链上分别自5’端起的前21个核苷酸任选地进行2’-O-核糖修饰，所述2’-O-核糖修饰选自2’-O-核糖甲基修饰、2’-O-核糖氟代修饰和2’-O-MOE核糖修饰。


3.一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其特征在于：由正义链和与其反向互补的反义链组成，所述正义链具有5’-CAAGCUGGUGGCCUAUAUGAUTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-AUCAUAUAGGCCACCAGCUUGTT-3’的反义核酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。


4.根据权利要求3所述的小干扰RNA，其特征在于：所述正义链和反义链上分别自5’端起的前21个核苷酸任选地进行2’-O-核糖修饰，所述2’...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔文浩，赵成江，王猛，郑智，田欢栋，
申请(专利权)人：佑嘉杭州生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33