牙髓干细胞的提取制造技术

本发明专利技术公开了牙髓干细胞的提取，收集完整拔出的健康的乳牙，75％乙醇擦拭灭菌；杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗，取出牙髓组织；眼科剪刀剪成2‑3的小块；牙髓组织小块用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后转移至10ml离心管；10ml离心管中加入0.4％的I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，在37℃水浴锅中消化；吹打离散单细胞团块，通过高速离心机进行离心，去上清液后用0.01mol/L杜氏磷酸盐缓冲液清洗离心，加入完全培养基，转移细胞到培养瓶。本发明专利技术通过杜氏磷酸盐缓冲液冲洗牙髓干细胞，且剪切碎块的细胞通过I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，在水浴锅中消化，从而得到获得精确的定性和纯化的牙髓干细胞，保证牙髓干细胞在体外培养性能稳定、可进行大量的扩增。

【技术实现步骤摘要】
牙髓干细胞的提取
本专利技术涉及一种提取技术，特别涉及牙髓干细胞的提取，属于髓干细胞

技术介绍
髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞，同其他组织一样，牙髓组织也具有修复与再生的能力，牙髓干细胞的成功获得表明在牙髓组织中同样存在保持未分化状态的成体干细胞，为牙齿发育研究及牙齿的再生奠定了基础。其后许多学者利用大鼠和家兔进行了系列体内、体外研究，均成功形成反应性牙髓－牙本质复合体样结构，证实了牙髓中存在具有成体干细胞特性的牙髓干细胞。而且还由于缺少特异性标记，目前无法获得精确的定性、定位和纯化，因此牙髓干细胞在体外培养还存在易变性、很难进行大量的扩增等问题，所有这些限制了牙髓干细胞的发展，但是牙髓干细胞的临床应用相信有一个广阔的前景，应用在牙髓再生和临床保存活髓治疗价值方面将有一个巨大的变革。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供牙髓干细胞的提取，以解决上述
技术介绍
中提出的牙髓干细胞在体外培养存在易变性、很难进行大量的扩增的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：牙髓干细胞的提取，所述牙髓干细胞提取的具体步骤为：S1：收集完整拔出的健康的乳牙，牙齿表面75％乙醇擦拭灭菌；S2：乳牙用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗，取出在超净工作台中轻轻取出牙髓组织；S3：牙髓组织用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后用眼科剪刀剪成2-3的小块；S4：牙髓组织小块用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后转移至10ml离心管；S5：10ml离心管中加入0.4％的I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，并在37℃水浴锅中消化2小时；S6：轻轻吹打离散单细胞团块后，通过高速离心机进行离心，调节其转速为1000r/min，离心6min；S7：去上清液后用0.01mol/L杜氏磷酸盐缓冲液清洗离心，再去上清液；S8：加入完全培养基，转移细胞到培养瓶，标记好后放入培养箱培养。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤S8中，所述完全培养基中含有FBS10％，2.5ug/ml两性霉素B，庆大霉素80U/ml或双抗1-2％，bFGF15ng/ml。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤S2中，所述杜氏磷酸盐缓冲液可为生理盐水，其加庆大霉素150U/ml或双抗2％。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S2中，所述牙髓组织的体积为1mm，所述杜氏磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤S8中，培养的具体步骤为：以104～105ml密度液，每3d换液l次，并收集对数生长期的培养上清备用，每日在倒置显微镜下观察，待细胞生长达80％～90％汇合时，胰酶消化收集细胞并计数。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术牙髓干细胞的提取，通过杜氏磷酸盐缓冲液冲洗牙髓干细胞，且剪切碎块的细胞通过I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，在水浴锅中消化，从而得到获得精确的定性和纯化的牙髓干细胞，保证牙髓干细胞在体外培养性能稳定、可进行大量的扩增。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了牙髓干细胞的提取的技术方案：牙髓干细胞的提取，牙髓干细胞提取的具体步骤为：S1：收集完整拔出的健康的乳牙，牙齿表面75％乙醇擦拭灭菌；S2：乳牙用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗，取出在超净工作台中轻轻取出牙髓组织；S3：牙髓组织用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后用眼科剪刀剪成2-3的小块；S4：牙髓组织小块用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后转移至10ml离心管；S5：10ml离心管中加入0.4％的I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，并在37℃水浴锅中消化2小时；S6：轻轻吹打离散单细胞团块后，通过高速离心机进行离心，调节其转速为1000r/min，离心6min；S7：去上清液后用0.01mol/L杜氏磷酸盐缓冲液清洗离心，再去上清液；S8：加入完全培养基，转移细胞到培养瓶，标记好后放入培养箱培养。步骤S8中，所述完全培养基中含有FBS10％，2.5ug/ml两性霉素B，庆大霉素80U/ml或双抗1-2％，bFGF15ng/ml。步骤S2中，所述杜氏磷酸盐缓冲液可为生理盐水，其加庆大霉素150U/ml或双抗2％。所述步骤S2中，所述牙髓组织的体积为1mm，所述杜氏磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L。步骤S8中，培养的具体步骤为：以104～105ml密度液，每3d换液l次，并收集对数生长期的培养上清备用，每日在倒置显微镜下观察，待细胞生长达80％～90％汇合时，胰酶消化收集细胞并计数。具体使用时，本专利技术牙髓干细胞的提取，收集完整拔出的健康的乳牙，牙齿表面75％乙醇擦拭灭菌；乳牙用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗，取出在超净工作台中轻轻取出牙髓组织；牙髓组织用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后用眼科剪刀剪成2-3的小块；牙髓组织小块用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后转移至10ml离心管；10ml离心管中加入0.4％的I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，并在37℃水浴锅中消化2小时；轻轻吹打离散单细胞团块后，通过高速离心机进行离心，调节其转速为1000r/min，离心6min；去上清液后用0.01mol/L杜氏磷酸盐缓冲液清洗离心，再去上清液；加入完全培养基，转移细胞到培养瓶，标记好后放入培养箱培养。在本专利技术的描述中，需要理解的是，指示的方位或位置关系仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。在本专利技术中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本专利技术中的具体含义。尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牙髓干细胞的提取，其特征在于，所述牙髓干细胞提取的具体步骤为：/nS1：收集完整拔出的健康的乳牙，牙齿表面75％乙醇擦拭灭菌；/nS2：乳牙用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗，取出在超净工作台中轻轻取出牙髓组织；/nS3：牙髓组织用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后用眼科剪刀剪成2-3的小块；/nS4：牙髓组织小块用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后转移至10ml离心管；/nS5：10ml离心管中加入0.4％的I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，并在37℃水浴锅中消化2小时；/nS6：轻轻吹打离散单细胞团块后，通过高速离心机进行离心，调节其转速为1000r/min，离心6min；/nS7：去上清液后用0.01mol/L杜氏磷酸盐缓冲液清洗离心，再去上清液；/nS8：加入完全培养基，转移细胞到培养瓶，标记好后放入培养箱培养。/n

【技术特征摘要】
1.牙髓干细胞的提取，其特征在于，所述牙髓干细胞提取的具体步骤为：
S1：收集完整拔出的健康的乳牙，牙齿表面75％乙醇擦拭灭菌；
S2：乳牙用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗，取出在超净工作台中轻轻取出牙髓组织；
S3：牙髓组织用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后用眼科剪刀剪成2-3的小块；
S4：牙髓组织小块用杜氏磷酸盐缓冲液反复冲洗后转移至10ml离心管；
S5：10ml离心管中加入0.4％的I型胶酶和0.4％的dipsase(1：1)混合液，并在37℃水浴锅中消化2小时；
S6：轻轻吹打离散单细胞团块后，通过高速离心机进行离心，调节其转速为1000r/min，离心6min；
S7：去上清液后用0.01mol/L杜氏磷酸盐缓冲液清洗离心，再去上清液；
S8：加入完全培养基，转移细胞到培养瓶，标记好后放入培养箱培养。


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【专利技术属性】
技术研发人员：黄火能，
申请(专利权)人：广东圆康再生医学科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44