一种人软骨细胞培养基及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人软骨细胞培养基，属于细胞技术领域，本发明专利技术对传统培养基进行优化，在基础培养基中添加外泌体、胎牛血清、青霉素‑链霉素，可以有效促进软骨细胞增殖，防止人软骨细胞脱分化，阻止其向纤维细胞样表型的转变，提高单层培养传代次数。本发明专利技术还提供了利用上述培养基对人软骨细胞分离培养的方法，可获取培养至第六代的正常软骨细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种人软骨细胞培养基及其应用
本专利技术属于细胞
，尤其涉及一种人软骨细胞培养基及其应用。
技术介绍
软骨细胞是一类软骨组成的重要细胞，软骨的各种组成成分基本上都是由软骨细胞分化或者分泌形成的，包括软骨基质以及软骨纤维等等。软骨细胞可以在体外培养、扩增，因此，在临床上有使用软骨细胞治疗软骨缺损的案例。外泌体是指包含了蛋白质、脂类和核酸的小膜泡，其特指直径在30～200nm的囊泡。外泌体易于保存，生物化学活性稳定、无潜在毒性。人脐带间充质干细胞由于其细胞年轻化、获得量大、无伦理问题、来源充足、高增殖特性、低免疫源性、无致瘤性等优势，临床应用广泛，疾病治疗效果明显，是获取外泌体的理想细胞来源之一。自体人关节软骨细胞移植是软骨组织工程应用的首选。自体人关节软骨细胞移植已成为一种公认的细胞疗法，被广泛用作治疗骨关节软骨缺损，组织工程化软骨再生及临床开展自体软骨细胞需要大量的、高质量的软骨细胞，但临床上开展自体软骨细胞植入用于治疗膝关节软骨缺损，经常遇到软骨增殖能力差，传代次数少，脱分化严重等问题。上述问题严重影响软骨细胞扩增数量及质量，降低临床治疗效果，阻碍自体软骨细胞的临床应用。软骨细胞属终末分化细胞，应用传统的培养方式基础培养基加血清、生长因子或一些化学物质在体外不易扩增培养，细胞一般传至3代以上就发生脱分化，软骨细胞标志物表达明显下降，基本不增殖。单层体外扩增导致软骨细胞功能丧失，并向成纤维细胞样表型的转变，因此，软骨细胞的特性限制了其相关的科学研究。因此，如何得到一种人软骨细胞培养基，提高软骨细胞的增殖能力和传代次数，降低脱分化现象，以获得大量的、高质量的软骨细胞成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种人软骨细胞培养基及其应用，有利于提高软骨细胞的增殖能力和传代次数，降低脱分化现象。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种人软骨细胞培养基，所述培养基在基础培养基的基础上添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。优选的，所述基础培养基在人软骨细胞培养基中的体积分数为85～92％。优选的，所述基础培养基为DMEM/F12。优选的，所述胎牛血清在人软骨细胞培养基中的体积分数为7～14％。优选的，所述外泌体在人软骨细胞培养基中的浓度为15～25μg/mL。优选的，所述外泌体来源于人脐带间充质干细胞。优选的，所述青霉素-链霉素溶液在人软骨细胞培养基中的体积分数为0.8～1.5％。优选的，所述人软骨细胞包括膝关节软骨细胞。本专利技术还提供了一种培养人软骨细胞的方法，包括：将人软骨细胞置于上述的人软骨细胞培养基中进行培养。优选的，所述培养包括原代培养和6代以内的传代培养。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术向基础培养基中添加人脐带间充质干细胞来源的外泌体，在有效促进软骨细胞增殖的同时，防止其脱分化，阻止其向成纤维细胞样表型的转变，提高了单层培养传代次数。本专利技术利用其培养基可将人软骨细胞培养至第六代，并且培养得到的第六代软骨细胞形态正常，呈多角形，仍具有较强增殖活力，且仍可以正常表达软骨细胞的标志物Ⅱ型胶原(COL2A1)和蛋白聚糖(ACAN)。本专利技术培养得到的人关节软骨细胞可以满足组织工程化软骨再生及临床开展自体软骨细胞治疗的需要。附图说明图1为外泌体培养基培养得到的第六代细胞人软骨细胞倒置相差显微镜采集图像；图2为常规培养基培养得到的第六代细胞人软骨细胞倒置相差显微镜采集图像；图3为培养得到的人软骨细胞增殖活力；图4为人软骨细胞标志物Ⅱ型胶原(COL2A1)mRNA相对表达水平；图5为人软骨细胞标志物蛋白聚糖(ACAN)mRNA相对表达水平。具体实施方式本专利技术提供了一种人软骨细胞培养基，所述培养基在基础培养基的基础上添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。本专利技术中基础培养基可选择哺乳动物体外细胞分离培养常用的培养基，优选为DMEM/F12。DMEM/F12培养基由DMEM和F12培养基按1:1结合得到的，利用F12含有较丰富的微量元素和DMEM含有各种氨基酸、较高浓度的葡萄糖为优点，适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。本专利技术对DMEM/F12的具体来源和培养基形态不作限定。本专利技术中基础培养基的体积分数为85～92％，进一步优选为89％。本专利技术在基础培养基中添加体积分数为7～14％的胎牛血清，其体积分数进一步优选为10％。胎牛血清是细胞培养中天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分；可以提供维持细胞指数生长的激素；提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，结合或调动它们所结合的物质活力；是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源。本专利技术对胎牛血清的具体来源不作限定。本专利技术在基础培养基中添加外泌体，所述外泌体优选为人脐带间充质干细胞外泌体。人脐带间充质干细胞外泌体包含多种因子，如转化生长因子(TGF)-b、血小板衍生生长因子(PDGF)和生长分化因子(GDF)-5，CD73蛋白等。同时，人脐带间充质干细胞外泌体中还包含多种miRNA，其中许多丰度较高miRNA可以促进软骨细胞的增殖，抑制其脱分化，如：miRNA-21-5p、miRNA-100-5p、miRNA-146a-3p等。本专利技术发现通过在基础培养基中添加外泌体，可有效促进软骨细胞增殖，防止其脱分化，阻止其向成纤维细胞表型的转变，提高单层培养传代次数。本专利技术中添加的外泌体浓度为15～25μg/mL，优选为18～22μg/mL，更进一步优选为20μg/mL。本专利技术在培养基中添加体积分数为0.8～1.5％的青霉素-链霉素溶液，其体积分数进一步优选为1％。青霉素-链霉素溶液具有广谱抗菌作用，青霉素抗革兰氏阳性菌，链霉素抗革兰氏阴性菌，两者联合使用具有协同增效的作用。本专利技术通过在培养基中添加青霉素-链霉素溶液，可有效避免人软骨细胞培养过程中染菌现象的发生。本专利技术对青霉素-链霉素溶液的具体来源不作限定。本专利技术对培养基的具体制备方法不作限定。作为一种可选的实施方式，当基础培养基为干粉形态时，配置本专利技术所述培养基的方法可以为：先将干粉形态的基础培养基加入无菌超纯水充分溶解，定容；再用0.2～0.22μm滤膜过滤得到无菌的澄清溶液；然后根据上述培养基的配方依次往基础培养基中添加其他组分，最终采用酸碱调节试剂调节pH值至7.0～7.5即可。本专利技术对所选择的酸碱调节试剂不做限制。作为另一种可选的实施方式，当基础培养基为液体形态时，配置本专利技术所述培养基的方法可以为：取适量液体形态的基础培养基；然后根据上述细胞培养基的配方添加其他组分，再采用酸碱调节试剂调节pH值符合配方要求至7.0～7.5即可。本专利技术对所选择的酸碱调节试剂不做限制。本专利技术还提供了利用上述培养基分离培养人软骨细胞的应用，可以用于培养原代人软骨细胞，也可以用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人软骨细胞培养基，其特征在于：在基础培养基的基础上添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种人软骨细胞培养基，其特征在于：在基础培养基的基础上添加胎牛血清、外泌体和青霉素-链霉素溶液。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基在人软骨细胞培养基中的体积分数为85～92％。


3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM/F12。


4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述胎牛血清在人软骨细胞培养基中的体积分数为7～14％。


5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述外泌体在人软骨细胞培养基中的浓度为15～25μg/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏东，姜文月，齐玲，赵贵芳，张佳，彭骞，
申请(专利权)人：清远市人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44