一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体制备及其应用。通过对培养基成分和添加血清含量进行研究，并对悬浮培养的各个参数进行优化，实现了对本发明专利技术的PPR‑N蛋白单克隆抗体的规模化生产。该方法能大幅度减少培养成本、增加单位体积内细胞数、提高单克隆抗体效价。通过纯化后的纯化浓缩液，单克隆抗体浓度可提高8倍，并且能保持原有的敏感性和特异性不变，可用于小反刍兽疫病毒抗体的免疫学检测。使用本发明专利技术制备的小反刍兽疫PPR‑N改良竞争ELISA试剂盒，能更显著地区分阴、阳性对照，二者间的差值更大，相比采用传统竞争ELISA方法，具有更好的敏感性和特异性。通过对比可见在传统竞争ELISA法无法区分阴阳性界限，本发明专利技术改良竞争ELISA法可准确的区分阴阳性界限。

【技术实现步骤摘要】
一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的制备及其应用
本专利技术涉及一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的制备及其应用。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants，PPR)俗称“羊瘟”，又名肺肠炎(pneumoenteritis)，是一种小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)引起的烈性传染病，主要感染的动物有羊亚科、长角羚等小反刍动物，发病率达90％以上，主要症状表现为高烧、口腔内膜炎、腹泻不止、肺炎等，在高危地区致死率可达100％。据FAO(2019年)推测，全球60％的小反刍类养殖行业受到该病的威胁。我国的第二产业就是养殖业，并且是经济体系不可分割的一部分，平均每年养羊量可达5.6-6亿只。该病2007年首次传入我国西藏阿里地区，随后几年间出现集体爆发疫情现象，发病率达100％，死亡率可达80％以上。由于我国规模化养殖体系的不完善和生物制品的匮乏，造成巨大的经济损失。此病是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须及时上报的动物疫病。截至目前，我国尚无成熟的小反刍兽疫诊断试剂申报注册，基本依靠进口诊断试剂。
技术实现思路
本专利技术人针对小反刍兽疫病原微生物诊断检测技术和抗原抗体生产纯化等关键技术问题特别是在病原微生物鉴定分离和单克隆抗体规模化生产技术上取得了实质性突破，获得单克隆抗体杂交瘤细胞，并对此细胞进行低血清培养基悬浮培养驯化，可以投放在大规模生产企业进行生产，并且生产成本比市场化培养基更加低廉。针对可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞进一步开发出了经济实用、特异性温和、敏感性高的小反刍抗体改良竞争ELISA试剂盒，将有助于小反刍兽疫检测技术缺乏的问题，并为我国养羊业带来显著的经济和社会效益。因此，本专利技术的目的是根据上述领域的需求和不足，本专利技术提供一种敏感性强、特异性温和、效价高的小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白的单克隆抗体，本专利技术单克隆抗体可以应用于检测小反刍兽疫病毒抗体。本专利技术的技术方案：1.一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体，其特征在于所述小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株分泌而得，该细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.21413；所述PPR-N蛋白单克隆抗体含有序列1，该序列是按大肠杆菌密码子特征进行优化后的小反刍兽疫N蛋白基因的主要抗原区序列。2.本专利技术所述一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的规模化生产方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，适应10％血清DMEM培养基；按照细胞数50万个/mL的转接量，细胞瓶转接摇瓶、摇瓶转接10L种子罐细胞生物反应器、再转接50L细胞生物反应器逐级放大培养，培养结束后，取样孔取样并且细胞计数，计数结果为600～650万个/mL。3.本专利技术所述一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体在改良竞争ELISA试剂盒中的应用，其特征在于，小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白的单克隆抗体和酶标板及其配套试剂组装成用于检测小反刍兽疫病毒。4.本专利技术所述一种用于检测小反刍兽疫病毒抗体改良竞争ELISA试剂盒及其配套试剂，其特征在于该小反刍兽疫病毒抗体改良竞争ELISA试剂盒使用改良竞争ELISA法检测血清标本中的小反刍兽疫病毒特异性抗体；所述的改良竞争ELISA法在于先在试剂盒的聚乙烯微孔板上预包被小反刍兽疫重组PPR-N蛋白纯化抗原，样品血清与抗原先进行特异性结合，再与单克隆抗体进行竞争性结合，此方法增强检测的敏感性和准确性。本专利技术取得的新技术效果本专利技术涉及一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体制备及其应用。通过对培养基成分和添加血清含量进行研究，并对悬浮培养的各个参数进行优化，实现了单克隆抗体的规模化生产。该方法能大幅度减少培养成本、增加单位体积内细胞数、提高单克隆抗体效价。通过纯化后的纯化浓缩液，单克隆抗体浓度可提高8倍，并且能保持原有的敏感性和特异性不变，可用于小反刍兽疫病毒抗体的免疫学检测。使用规模化生产的小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体，并对反应时间和样品添加顺序进行了优化，制备了小反刍兽疫PPR-N改良竞争ELISA试剂盒，能更显著地区分阴、阳性对照，二者间的差值更大，相比采用传统竞争ELISA方法，具有更好的敏感性和特异性。通过试验数据对比，在传统竞争ELISA法无法区分阴阳性界限，改良竞争ELISA法可以成功并且准确的区分阴阳性界限。本专利技术涉及微生物资源信息本专利技术所用免疫抗原为小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白，参照NCBI的公布的小反刍兽疫病毒N蛋白抗原的核苷酸序列，由本实验室选取其中N末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列，克隆到pET28a(+)表达载体后，转化大肠杆菌TransettaDE3进行表达，将表达产物纯化后，作为免疫抗原。检测抗原为小反刍兽疫病毒浓缩抗原，选用的毒种为Clone9疫苗株，由中国兽医微生物菌种保藏中心提供。具体实施方式1.单克隆抗体杂交瘤细胞的培育参照NCBI的公布的小反刍兽疫病毒N蛋白抗原的核苷酸序列，选取N末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列(序列1)，并克隆到pET28a(+)表达载体，转化大肠杆菌进行原核表达。小反刍兽疫病毒Clone9疫苗株接种生长良好的Vero细胞，经多代培养后，使用Purose6FastFlow填料纯化病毒，即为小反刍兽疫病毒浓缩纯化液。将重组PPR-N蛋白作为抗原对Balb/c小鼠进行免疫，当抗体效价达到1:20000以上，取脾细胞悬液与SP20细胞按一定比例融合后铺板，5％CO237℃静置培养。融合后第4、8天半量换液。融合后第12天，取细胞板孔底部出现细胞簇的上清液进行筛选。对强阳性孔进行扩繁与亚克隆,经三次亚克隆后置液氮中冻存。该小反刍融合细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.21413。2.本专利技术所述一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，适应10％血清DMEM培养基；按照细胞数50万个/mL的转接量，细胞瓶转接摇瓶，摇瓶转接10L细胞生物反应器。培养72h时，进行种子罐转接50L细胞生物反应器。50L反应器装液量在50％左右；转速控制在70～100r/min；pH值控制在7.0～7.2范围内；DO值变化控制在40％以下；CO2值前期控制在4％～5％左右；温度控制在(37±1)℃；罐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体，其特征在于所述小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株分泌而得，该细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.21413。/n

【技术特征摘要】
1.一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体，其特征在于所述小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株分泌而得，该细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.21413。


2.一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的规模化生产方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR-N(P-1-5)，适应10％血清DMEM培养基；按照细胞数50万个/mL的转接量，细胞瓶转接摇瓶、摇瓶转接10L种子罐细胞生物反应器、再转接50L细胞生物反应器逐级放大培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘硕，孙亚波，徐建成，张明薇，沈青春，才学鹏，迟鑫，王凤霞，
申请(专利权)人：北京中海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11