mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法、抗-反向帽类似物及应用技术

本发明专利技术提供了一种mRNA体外转录过程中抗‑反向帽类似物的回收方法、抗‑反向帽类似物及应用，涉及生物技术领域，本发明专利技术提供的mRNA体外转录过程中抗‑反向帽类似物的回收方法，适用于任何类型mRNA的体外转录过程，该回收方法通过高效液相色谱法初步分离mRNA转录反应后的反应液中的抗‑反向帽类似物，再将初步分离得到的抗‑反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后，即可得到抗‑反向帽类似物，实现对抗‑反向帽类似物的重复利用。该回收方法有效降低了mRNA生产的成本，提高了原料的利用效率。

【技术实现步骤摘要】
mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法、抗-反向帽类似物及应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法、抗-反向帽类似物及应用。
技术介绍
信使RNA(mRNA)药物是一种极具潜力的新治疗方案，在免疫学、肿瘤学和疫苗等领域都有广泛前景。mRNA包含着细胞制造蛋白质并将其送到身体各个部位的指令，因此mRNA作为药物使用可指导细胞内蛋白质表达或者细胞外蛋白分泌。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。mRNA原液产品的基本结构至少包括：5‘帽子结构以及具体编码蛋白质的mRNA序列(图1)。其中，mRNA的5‘帽子结构尤为关键。细胞内的核糖体通过mRNA的5‘帽子结构将mRNA的序列翻译成蛋白质。且帽子能够使mRNA更稳定不致被外切核酸酶降解，不带帽子的mRNA无法正常编码蛋白。因此生产mRNA产品的过程中，确保mRNA带有5’帽子结构的加帽反应尤为重要。mRNA原液的生产是通过体外酶催化反应进行的。具体为在反应中，T7RNA转录酶以线性化的DNA质粒为模板，以抗-反向帽类似物(ARCA：AntiReverseCapAnalog)为例，和核苷三磷酸混合物NTPs(包括腺苷三磷酸ATP,尿苷三磷酸UTP,胞苷三磷酸CTP和鸟苷三磷酸GTP)为原料，通过转录反应完成(图2)。其中，帽子结构为图示中蓝色标记。mRNA的加帽是在DNA转录mRNA的反应过程中，通过ARCA抗-反向帽类似物(帽子)和NTPs同时反应完成的，将该生产过程称为共转录反应。通过反应过程可以发现，由于抗-反向帽类似物和鸟苷三磷酸(GTP)在化学结构上的相似性，且T7RNA转录酶对二者的反应活性相同，因此共转录反应会产生一定比例的不加帽产物。该产物为无效杂质，在mRNA药物生产过程中应该尽量避免。为了提高反应产物的加帽比例，在实际生产过程中，通过提高ARCA的用量(ARCA：GTP＝4：1)来保障～80％左右的加帽效率。对于一般的含有数百个到数千个碱基的mRNA产品来说，由于合成后的mRNA中仅含有一个帽子结构(由抗-反向帽类似物产生)和数百上千个碱基(由NTPs原料产生)，因此转录反应对反应起始原料中的抗-反向帽类似物的利用率可能仅有其他NTPs原料利用率的数千分之一。再加上抗-反向帽类似物的原料成本远超其他反应原料，因此开发该抗-反向帽类似物化合物的循环利用技术具有巨大的产业化意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术的第二个目的在于提供采用上述回收方法回收得到的抗-反向帽类似物。本专利技术的第三个目的在于提供上述回收得到的抗-反向帽类似物在mRNA体外转录中的应用。本专利技术提供了一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法，通过高效液相色谱法分离mRNA转录反应后的反应液中的抗-反向帽类似物，得到抗-反向帽类似物粗品，将抗-反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后，得到抗-反向帽类似物。进一步地，所述抗-反向帽类似物包括ARCA、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP中的一种或多种。进一步地，所述色谱法包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法或反相高效液相色谱法，优选为反相高效液相色谱法。进一步地，利用透析法对抗-反向帽类似物粗品进行纯化。进一步地，利用真空离心的方法对纯化后的抗-反向帽类似物进行浓缩和干燥。进一步地，将mRNA转录反应后的反应液进行预处理后，再通过高效液相色谱法分离抗-反向帽类似物。进一步地，所述预处理包括使用流动相稀释mRNA转录反应后的反应液；优选地，所述流动相包括TEAA，优选为0.05-0.2M的TEAA；优选地，所述稀释倍数为1-3倍，优选为2倍。进一步地，所述高效液相色谱法包括如下步骤：(a)反应液预处理：将mRNA转录反应后的反应液用流动相稀释1-3倍，得到待分离反应液；(b)采用反相高效液相色谱对步骤(a)得到的待分离反应液进行分离，色谱条件至少满足以下条件之一：流动相为0.05-0.2M的TEAA；流速为0.8-1.2ml/min；柱温为42-48℃；待分离反应液进样量为80-120μl。本专利技术还提供了采用上述的回收方法回收得到的抗-反向帽类似物。另外，本专利技术还提供了上述的抗-反向帽类似物在mRNA体外转录中的应用。本专利技术提供的mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法，适用于任何类型mRNA的体外转录过程，该回收方法通过高效液相色谱法初步分离mRNA转录反应后的反应液中的抗-反向帽类似物，再将初步分离得到的抗-反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后，即可得到抗-反向帽类似物，实现对抗-反向帽类似物的重复利用。该回收方法有效降低了mRNA生产的成本，通过回收再利用提高了原料的利用效率。并且，采用本专利技术提供的回收方法所回收得到的抗-反向帽类似物，能在后续新的转录反应中正常发挥其作用，得到与全新的帽子一样的效果，可再次用于合成高质量的mRNA产品。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为mRNA原液产品的基本结构的示意图；图2为以抗-反向帽类似物(ARCA)为例，和核苷三磷酸混合物NTPs为原料发生转录反应过程的示意图；图3为RNA共转录反应后剩余的初始反应原料的液相色谱图，经过和NTP混合物和抗-反向帽类似物的液相谱图对比，分别确认其ID；图4为通过色谱回收后的抗-反向帽类似物液相色谱图，其保留时间和标准品一致；图5为抗-反向帽类似物回收纯化前后叠加的液相色谱图，确定抗-反向帽类似物回收；图6为紫外分光光度法测定抗-反向帽类似物浓度的标准曲线。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。除非本文另有定义，连同本专利技术使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法，其特征在于，通过高效液相色谱法分离mRNA转录反应后的反应液中的抗-反向帽类似物，得到抗-反向帽类似物粗品，将抗-反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后，得到抗-反向帽类似物。/n

【技术特征摘要】
1.一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法，其特征在于，通过高效液相色谱法分离mRNA转录反应后的反应液中的抗-反向帽类似物，得到抗-反向帽类似物粗品，将抗-反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后，得到抗-反向帽类似物。


2.根据权利要求1所述的回收方法，其特征在于，所述抗-反向帽类似物包括ARCA、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP中的一种或多种。


3.根据权利要求1所述的回收方法，其特征在于，所述色谱法包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法或反相高效液相色谱法，优选为反相高效液相色谱法。


4.根据权利要求1所述的回收方法，其特征在于，利用透析法对抗-反向帽类似物粗品进行纯化。


5.根据权利要求1所述的回收方法，其特征在于，利用真空离心的方法对纯化后的抗-反向帽类似物进行浓缩和干燥。


6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏晓晔，李爽，雷奕欣，朱雅婧，彭育才，
申请(专利权)人：珠海丽凡达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44