一种芝麻离体再生培养方法以及百里香酚作为所用培养基添加剂的应用技术

本发明专利技术公开了一种芝麻离体再生培养方法，并首次公开了百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高芝麻外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。本发明专利技术利用含有百里香酚的培养基配方，以芝麻幼苗的子叶作为外植体，建立了一种快速、高效的芝麻离体再生技术体系，解决了目前芝麻组织培养中的外植体容易褐化、培养周期长、重复性差、基因型依赖性强和植株再生频率低等一些突出问题，为芝麻的快速繁殖、种质保存与创新以及转基因技术应用提供了一种简便可靠的技术方法。

【技术实现步骤摘要】
一种芝麻离体再生培养方法以及百里香酚作为所用培养基添加剂的应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种芝麻离体再生培养方法，本专利技术还涉及百里香酚作为所用培养基中添加剂的应用。
技术介绍
在植物组织培养领域，芝麻是目前公认的属于组织培养困难的几种作物之一，迄今仍面临外植体容易褐化、组织培养周期长、重复性差、基因型依赖性强和植株再生频率低等一系列突出问题，不易获得完整的离体再生植株。因此，芝麻组织培养尚未有效地应用于芝麻的遗传改良，并且以此技术为基础的芝麻转基因研究也受到巨大限制。目前，国内外虽有少数关于芝麻愈伤组织诱导及分化与植株再生获得成功的公开报道，但人们却很难对这些技术方法进行重复验证，而且植株再生频率也很低，一般仅为0.1%到10%左右。也有报道记载了利用从芝麻种子中剥取的子叶作为外植体进行离体培养，比较容易获得丛生芽的方法，但是该文作者却没有在后续的实践中成功加以应用。鉴于对该技术进行深入研究和应用的需要，当前迫切需要建立一套可靠而行之有效的芝麻离体再生的技术，以便满足芝麻遗传改良和生产发展的需求。百里香酚(5-methyl-2-Isopropylphenol；或者Thymol)，又名麝香草酚，是一种天然存在于植物中的单萜酚类物质，具有广泛的杀菌、抗氧化、消炎、抗肿瘤和杀虫等活性，常用于制作香料、防腐剂、药物和指示剂等，但在植物组织培养领域中的应用却未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种芝麻离体再生培养方法，为芝麻的遗传改良和进一步研究提供了新的技术思路。本专利技术还提供了百里香酚在植物组织培养基中的应用。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的一种芝麻离体再生培养方法，其中在愈伤组织的诱导及分化与再生幼苗的生根培养阶段所用的培养基中均添加有百里香酚，其具体培养方法包括下述步骤：第一步，无菌苗培养按1L的1/2MS（Murashige&Skoog）培养基中加入30g蔗糖,8g琼脂粉的比例配制生长培养基备用；选取籽粒饱满的芝麻种子用乙醇和水清洗干净，再用配制的HgCl2溶液处理，然后用无菌水清洗干净后种植在生长培养基上置于培养室内培养6天，获得无菌苗；第二步，切取子叶外植体将第一步获得的无菌苗用手术刀切取子叶外植体，并保留2mm叶柄；第三步，愈伤组织的诱导及分化按1L的MS减铵培养基（这里是指不含硝酸铵的MS基础盐培养基）中加入6-苄基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例，配制诱导及分化培养基备用；将第二步切取的子叶外植体接种到诱导及分化培养基上，置于培养室内离体培养；培养过程中，首先可观察到外植体明显膨大，然后在子叶柄的伤口处出现愈伤组织，进而可看到分化产生的再生芽；当再生芽长到高度1cm左右时，切除未分化的外植体部分，仅保留带有愈伤组织的再生幼苗继续培养；在整个培养过程中，每两周进行一次继代培养；第四步，再生幼苗的生根培养按1L的MS培养基中加入吲哚丁酸0.5mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例配制生根培养基备用；当再生幼苗生长到高度1.5-2.0cm时，转移到生根培养基上，置于培养室中诱导再生苗的生根，直至长成发达的根系，得到完整的再生植株。所述生长培养基，诱导及分化培养基和生根培养基配制时，利用氢氧化钾调节pH值，培养基灭菌后的pH约为5.7-5.9。第一步中无菌苗培养时，首先利用黑布遮光培养4天，然后去掉黑布继续培养2天；培养室内条件为：温度25±2℃；湿度65%；16h光照、8h黑暗交替进行，光照强度5000-6000Lux。本专利技术所述的百里香酚作为植物组织培养基添加剂的应用。具体来说，百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高植物外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。进一步的，百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高芝麻外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。本专利技术的优点在于以芝麻幼苗的子叶为外植体材料，应用本专利技术配制的各培养阶段专用的培养基，建立了一种能快速、高效的促进和提高外植体的愈伤组织诱导及分化、再生幼苗生根的技术，该方法解决了当前芝麻组织培养中外植体容易褐化，培养周期长，重复性差，基因型依赖性强和植株再生频率低等一些突出的技术问题，有利于促进芝麻的遗传改良。在本专利技术配制的诱导及分化培养基和生根培养基中，申请人创造性的添加了常用于制作香料、防腐剂、药物和指示剂等的百里香酚，显著的促进和提高了外植体的愈伤组织诱导及分化率，并促进和提高了对再生幼苗的诱导生根及其生长发育，为芝麻的快速繁殖、种质保存与创新以及转基因技术应用提供了一种可靠的技术方法。附图说明图1是切取的子叶外植体接种在本专利技术诱导及分化培养基（T）与对照培养基（C）上第1天的状态对比照片。图2是子叶外植体接种在本专利技术诱导及分化培养基（T）与对照培养基（C）上第8天的状态对比照片。图3是子叶外植体接种在本专利技术诱导及分化培养基（T）与对照培养基（C）上第10天的状态对比照片。图4是子叶外植体接种在本专利技术诱导及分化培养基（T）与对照培养基（C）上第14天的状态对比照片。图5是子叶外植体分别接种在本专利技术诱导及分化培养基（T）与对照培养基（C）上产生再生芽的统计结果对比。图6是子叶外植体分别接种在本专利技术诱导及分化培养基（T）与对照培养基（C）上培养28天后所产生的再生幼苗的生长状态对比。图7是再生幼苗分别转移到本专利技术生根培养基（RT）与对照生根培养基（RC）上诱导生根12天的生长状态对比。图8是再生幼苗分别转移到本专利技术生根培养基（RT）与对照生根培养基（RC）上诱导生根14天的根系生长状态对比。图9是移栽到土壤中生长的完整再生植株。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。实施例1本专利技术的一种芝麻离体再生培养方法，包括下述具体步骤：第一步，无菌苗培养按1L的1/2MS培养基中加入30g蔗糖,8g琼脂粉的比例配制生长培养基备用；选取籽粒饱满的芝麻种子60-70粒分装在1.5mL的Eppendorf离心管中，加入1mL左右的70%乙醇，上下颠倒反复冲洗1min，弃掉废液，然后加入1mL的无菌水，冲洗1min，弃掉废液。加入1mL配制的0.1%HgCl2处理5min，弃掉废液，然后加入无菌水重复清洗5次。将处理好的种子种植在生长培养基上，置于培养室（16h光照/8h黑暗，温度25±2℃，湿度65%，光照强度5000-6000Lux）中。先利用黑布进行遮光培养4天，然后去掉黑布继续培养2天，获得无菌苗；第二步，切取子叶外植体将第一步获得的无菌苗使用灭菌的手术刀切取子叶外植体，注意需要携带2mm左右叶柄；第三步，愈伤组织的诱导及分化按1L的MS减铵培养基中加入6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.百里香酚作为植物组织培养基添加剂的应用。/n

【技术特征摘要】
1.百里香酚作为植物组织培养基添加剂的应用。


2.百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高植物外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。


3.百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高芝麻外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。


4.一种芝麻离体再生培养方法，其特征在于：在愈伤组织的诱导及分化与再生幼苗的生根培养阶段所用的培养基中均添加有百里香酚，其具体培养方法包括下述步骤：
第一步，无菌苗培养
按1L的1/2MS培养基中加入30g蔗糖,8g琼脂粉的比例配制生长培养基备用；
选取籽粒饱满的芝麻种子用乙醇和水清洗干净，再用配制的HgCl2溶液处理，然后用无菌水清洗干净后种植在生长培养基上置于培养室内培养6天，获得无菌苗；
第二步，切取子叶外植体
将第一步获得的无菌苗用手术刀切取子叶外植体，并保留2mm叶柄；
第三步，愈伤组织的诱导及分化
按1L的MS减铵培养基中加入6-苄基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例，配制诱导及分化培养基备用；
将第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐如强，张雪，刘金蕊，李道朋，崔旭杰，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41