抑制微小RNA的修饰核酸及其用途制造技术

本发明专利技术涉及抑制微小RNA的修饰核酸及其用途。根据本发明专利技术的抑制微小RNA的修饰核酸可通过在微小RNA种子区域上连续排列至少两个包含最少6个互补结合核苷酸序列的微小RNA靶位点而与微小RNA牢固结合，并且，由于在微小RNA靶位点之间插入了脱碱基间隔子，不仅有效抑制了微小RNA，而且还具有插入所述修饰核酸中的所述序列的有益效果，从而可防止与其他微小RNA意外结合。可以使用micro RNA的规范靶标识别，也可以使用micro RNA的非规范靶标识别，例如成核凸出位点和G:A或G:U摆动排列位点，并且可以选择性地抑制由于微小RNA的非规范靶标识别引起的生物学功能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抑制微小RNA的修饰核酸及其用途
本专利技术涉及抑制微小RNA的修饰核酸及其用途，更具体地，涉及与微小RNA互补结合的抑制微小RNA的修饰核酸及其用途。本申请要求于2018年5月31日提交的韩国专利申请10-2018-0063047和于2019年5月31日提交的韩国专利申请10-2019-0064767的优先权和利益，并且其说明书和附图的公开内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
RNA干扰是在转录后水平上抑制基因表达的现象，并且被广泛用作通过将引起这种现象的RNA物质引入细胞中以人为地诱导基因沉默来抑制所需靶基因的技术。RNA干扰实际上是由约21个核苷酸(称为微小RNA(miRNA))组成的小RNA介导的，并且miRNA通过与种子(seed)区域(位置1-8)(尤其在miRNA的5'末端)进行碱基配对，识别mRNA中的数百个靶基因并抑制其表达，从而显示出生物学功能。具体而言，作为天然存在的诱导RNA干扰的核酸的微小RNA与Argonaute蛋白形成复合物，然后通过互补碱基配对与靶标结合。在此，对于在动物中发现的miRNA，当从miRNA的5'端起的位置1至8中(最重要的是位置2至7中)的至少6个连续碱基的序列(称为种子区域)与靶mRNA配对时，靶mRNA的表达被抑制。由于上述类型的碱基序列最常出现，因此将其定义为miRNA的规范(canonical)靶标，并且这些类型的互补序列对于miRNA的规范生物学功能非常重要。然而，最近，由于诸如可以对miRNA靶标进行实验测序的AgoHITS-CLIP的技术，因此已发现存在许多违反规则的非规范靶标，而不是识别诸如种子区域的规范靶标。由于miRNA通过识别靶mRNA并抑制其表达而表现出生物学功能，因此它可以用作这样一种机制，其中核苷酸序列在与靶mRNA竞争的同时可以与miRNA的种子区域互补配对，从而抑制了由miRNA诱导的生物学功能(EbertMS等人,NatMethods.2007Sep；4(9):721-6)。特别地，在具有引起疾病的功能的miRNA的情况下，可以通过特异性抑制该功能来将其用作治疗剂。miRNA的抑制剂通常可包含与miRNA整个序列几乎完全互补的序列，因此以通过与miRNA进行特异性碱基配对来抑制功能的模式被广泛使用。然而，这种类型可以抑制特定的miRNA，但不能区分被miRNA识别的规范靶标和用于抑制的非规范靶标。因此，当将其用作药物时，它可能会产生不利影响，也抑制所有生物学上所需的miRNA功能。
技术实现思路
[技术问题]专利技术人进行了认真的研究，发现miRNA中的实际靶标识别区域是从5'端开始的位置1至8之间(显著地是从5'端开始的位置2至7之间)的种子区域，因此可能仅通过与种子区域互补的序列与miRNA充分结合。可以确认的是，如果存在与种子区域互补的短8-nt序列，则可能竞争性地抑制miRNA的规范靶标识别，并且当在同一分子中反复存在如此短的miRNA结合位点时，与整个序列与miRNA互补的情况相比，它们能够与miRNA更加牢固地配对。实际上，根据AgoHITS-CLIP分析，可以观察到在各种miRNA的靶mRNA中3'UTR处连续存在若干个短种子靶位点。因此，基于以上描述，本专利技术旨在提供抑制miRNA的修饰核酸，其包括两个或多个碱基的短序列，根据miRNA靶标识别规则，其能够被识别为与miRNA结合的miRNA靶标。[技术方案]为了实现上述目的，本专利技术提供了具有以下特征的抑制miRNA的修饰核酸。本专利技术提供了抑制miRNA的修饰核酸，其中修饰核酸连续包含至少两个miRNA靶位点序列，每个序列由至少6个核苷酸组成，miRNA靶位点序列可以是选自以下的一种:1)与从miRNA5'端开始2至7位或3至8位碱基互补的序列；2)与从miRNA5'端开始2至7位碱基互补并且在5至6位碱基之间具有凸起(bulge)的序列，和3)与从miRNA5'端开始2至7位或3至8位碱基互补并且具有互补的G:A或G:U摆动碱基对的序列，以及在miRNA靶位点序列之间，至少一个碱基被脱碱基间隔子(spacer)替代。另外，本专利技术提供了制备抑制miRNA的修饰核酸的方法，该方法包括:连续地排列选自以下项中的一个：1)与从miRNA的5'端开始2至7位或3至8位碱基互补的序列，2)与从miRNA的5'端开始2至7位碱基互补并且在5至6位碱基之间具有凸起的序列，和3)与从miRNA的5'端开始2至7位或3至8位碱基互补并且具有互补的G:A或G:U摆动碱基对的序列；和在连续排列的碱基序列之间用脱碱基间隔子替代至少一个碱基。另外，本专利技术提供了抑制miRNA的方法，其包括体外将抑制miRNA的修饰核酸引入细胞。另外，本专利技术提供了包括抑制miRNA的修饰核酸的基因转移系统。在本专利技术的一实施方案中，miRNA可以是miRNA-1。在本专利技术的另一实施方案中，抑制miRNA的修饰核酸可以包括5'-ACAUUCCA-3'(抗miR-1-种子位点；SEQIDNO:1)或5'-AAAUUCCA-3'(抗miR-1-7G:A种子位点；SEQIDNO:2)序列。在本专利技术的另一实施方案中，抑制miRNA的修饰核酸可以连续包含至少两个5’-ACAUUCCA-3’序列，并且在该序列之前和之后包含至少一个脱碱基间隔子。在本专利技术的另一实施方案中，抑制miRNA的修饰核酸可以连续地包括至少两个5’-AAAUUCCA-3’序列，并且在该序列之前和之后包含至少一个脱碱基间隔子。在本专利技术的另一实施方案中，miRNA靶位点序列可以包含与miRNA的种子区域互补的6至8个核苷酸。在本专利技术的又一实施方案中，种子区域可以是从miRNA的5'末端开始的位置1至8的碱基的序列。在本专利技术的又一实施方案中，所述脱碱基间隔子可以是选自以下的一种或多种:脱碱基核糖核苷酸间隔子(rSpacer，rSp)，脱碱基脱氧核糖核苷酸间隔子(dSpacer)，C3间隔子和C6间隔子，其不包含碱基，以及不含碱的所有间隔子修饰剂之一。[有益效果]根据本专利技术的抑制miRNA的修饰核酸可以通过连续地排列至少两个由至少6-nt序列组成的miRNA靶位点从而与miRNA的种子区域互补结合，并通过在miRNA靶位点之间引入脱碱基间隔子而与miRNA牢固结合，不仅具有有效抑制miRNA的作用，而且还可以防止由于其他miRNA或RNA结合蛋白与引入修饰核酸的序列边界区域处形成的核苷酸序列之间的意外相互作用引起的竞争抑制。此外，修饰核酸还可以使用miRNA的非规范靶位点(例如miRNA的成核凸起位点和G:A或G:U摆动配对位点)以及规范靶位点，因此预期仅由miRNA的非规范靶标识别表现出的生物学功能可以被选择性抑制。附图说明图1是图示了串联靶miRNA抑制剂的作用机理的图，所述串联靶miRNA抑制剂是根据本专利技术的抑制miR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制miRNA的修饰核酸，其包括:/n至少两个连续的miRNA靶位点序列，每个序列由至少6个核苷酸组成，/n其中所述miRNA靶位点序列是选自以下的一种:/n1)与从miRNA的5'端开始2至7位或3至8位碱基互补的序列，/n2)与从miRNA的5'端开始2至7位碱基互补并且在5至6位碱基之间具有凸起的序列，和/n3)与从miRNA的5'端开始2至7位或3至8位碱基互补并且具有互补的G:A或G:U摆动碱基对的序列，以及/n在所述miRNA靶位点序列之间，至少一个碱基被脱碱基间隔子替代。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180531 KR 10-2018-00630471.一种抑制miRNA的修饰核酸，其包括:
至少两个连续的miRNA靶位点序列，每个序列由至少6个核苷酸组成，
其中所述miRNA靶位点序列是选自以下的一种:
1)与从miRNA的5'端开始2至7位或3至8位碱基互补的序列，
2)与从miRNA的5'端开始2至7位碱基互补并且在5至6位碱基之间具有凸起的序列，和
3)与从miRNA的5'端开始2至7位或3至8位碱基互补并且具有互补的G:A或G:U摆动碱基对的序列，以及
在所述miRNA靶位点序列之间，至少一个碱基被脱碱基间隔子替代。


2.根据权利要求1所述的修饰核酸，其中所述miRNA是miR-1。


3.根据权利要求1所述的修饰核酸，其中所述抑制miRNA的修饰核酸包含5'-ACAUUCCA-3'或5'-AAAUUCCA-3'序列。


4.根据权利要求3所述的修饰核酸，其中所述抑制miRNA的修饰核酸连续包含至少两个5'-ACAUUCCA-3'序列，以及在所述序列之前和之后的至少一个脱碱基间隔子。


5.根据权利要求3所述的修饰核酸，其中所述抑制miRNA的修饰核酸连续包含至少两个5'-AAAUUCCA-3'序列，以及在所述序列之前和之...

【专利技术属性】
技术研发人员：池晟旭，张恩淑，石熙暎，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR