CRM197蛋白质表达制造技术

本发明专利技术关于在细胞中生产CRM197重组蛋白质的方法。该方法包括培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细胞，并诱导该CRM197蛋白质的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRM197蛋白质表达相关申请的交互引用本申请主张于2018年1月19日申请的美国临时申请案62/619,449的权益，该临时申请案的全部内容透过引用并入。
本公开内容涉及细菌宿主中生产重组蛋白质的领域。特别是，本专利技术涉及自细菌细胞中获得折叠良好的可溶性重组CRM197蛋白质的方法。本公开内容还涉及该重组CRM197蛋白质的表达质粒及宿主细胞。
技术介绍
白喉毒素(Diphtheriatoxin,DT)是一种蛋白质性外毒素，其由病原体，例如，白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)所合成。产毒菌株含有携带该毒性基因的噬菌体溶素原。白喉毒素(DT)被合成为535个氨基酸的多肽，其含有透过二硫键连接在一起的片段A(催化结构域)以及片段B(受体结合及跨膜结构域)。该毒素与细胞受体(HB-EGF-受体)结合并透过胞吞作用进入该细胞，其中该片段A透过蛋白质水解切割而自该片段B释放。片段A可以透过在哺乳动物延伸因子2(elongationfactor2,EF-2)中在组氨酸715处催化ADP-核糖基转移至白喉酰胺(diphthamide)的N-1而抑制蛋白质翻译。因此，白喉毒素(DT)可透过与细胞表面受体结合，进入胞质溶胶，并使核糖体延伸因子2(EF-2)失活而杀死真核细胞。交叉反应材料197(cross-reactingmaterial197,CRM197)的基因由突变噬菌体β197tox-携带。CRM197为一种无毒形式的白喉毒素，其含有谷氨酸到甘氨酸(G52E)的单个氨基酸取代并丧失其ADP-核糖基转移酶活性但保留结合活性。CRM197通常用作多糖或寡糖结合型疫苗中的载体。其为一种针对荚膜细菌的结合型疫苗的理想载体。包含与不良免疫原性及T细胞非依赖性荚膜多糖共价缀合的CRM197的结合型疫苗产生高度免疫原性并导致对该抗原长期免疫性的接合抗原。其已被广泛用作几种疫苗中的载体蛋白质，例如，Hib疫苗(NovartisVaccines公司)，七价及13价肺炎球菌疫苗(Wyeth公司)以及脑膜炎球菌血清群C结合型疫苗(NovartisVaccines公司与Wyeth公司)。最近的研究显示，CRM197可以抑制肝素结合表皮生长因子(heparin-bindingepidermalgrowthfactor,HB-EGF)，这是一种表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)配体。EGFR及其配体参与细胞发育、增殖及分化，并可诱导肿瘤形成。总之，CRM197为一种结合型疫苗中常用的载体蛋白质。其高纯度、均质的结构以及赖氨酸残基的可用性，能够生产出定义明确且具有特征的糖复合疫苗。CRM197的这些具吸引人的特征已被用于开发各种具有已被证实免疫原性的基于CRM197的结合型疫苗。
技术实现思路
于本申请中，提供了一种新方法来产生适当折叠的可溶性CRM197蛋白质，其形成具有正确的二硫键，例如，2个内二硫键。在一方面，本文提供了一种产生CRM197蛋白质的方法。该方法包括培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细菌细胞的步骤；并诱导该CRM197蛋白质的表达。该多核苷酸包含：(a)与SEQIDNO:1至少90％相同的CRM197核苷酸序列，以及(b)分泌信号序列，于该CRM197核苷酸序列的5’端编码SEQIDNO:2的氨基酸。优选地，该分泌信号序列可为果胶酸裂解酶B(pectatelyaseB,PelB)序列。更优选地，该PelB序列来自欧文氏菌属种(Erwiniaspp.)。优选地，该表达质粒可包含磷酸盐调节的启动子。更优选地，该磷酸盐调节的启动子可为细菌性碱性磷酸酶A启动子。优选地，该细菌细胞可包含大肠杆菌(Escherichiacoli)。更优选地，该大肠杆菌可为BL21感受态细胞。优选地，该CRM197蛋白质可为可溶的、周质的及/或适当折叠的。更优选地，该CRM197蛋白质可包含内二硫键。优选地，该CRM197蛋白质的表达温度为首先于37℃温育，然后降低至约20-25℃。优选地，该诱导在pH7.0-8.0于储存缓冲液中进行。优选地，该储存缓冲液系选自由MOPS缓冲液、Tris缓冲液以及铵缓冲液所组成的组。于另一方面，本文提供了一种多核苷酸。该多核苷酸包括：(a)与SEQIDNO:1至少90％相同的CRM197核苷酸序列，以及(b)分泌信号序列，于该CRM197核苷酸序列的5’端编码SEQIDNO:2的氨基酸。于另一方面，本文提供了一种表达质粒。该表达质粒包含上述的多核苷酸，以及启动该多核苷酸表达的诱导型启动子。于另一方面，本文提供了一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述的多核苷酸或上述的表达质粒。于另一方面，本文提供了一种CRM197重组蛋白质。该蛋白质由于2017年11月28日以ATCC登录号PTA-124609保藏的表达质粒所产生。于另一方面，本文提供了一种CRM197重组蛋白质。该蛋白质包含(a)多肽，其与从SEQIDNO:1的核苷酸转录的氨基酸序列至少90％相同，以及(b)SEQIDNO:2的分泌信号序列，位于该多肽的N端。鉴于所附图式与以下描述，本专利技术之其他方面将会显而易见。附图说明图1显示了编码CRM197的基因及氨基酸序列。加底线的序列为5’-HindIII以及3’-EcoRI限制酶切位。图2显示了pelBss-CRM197_pEGm-phoA1.0的质粒图谱。图3显示了CRM197构建体的琼脂糖凝胶图像。透过HindIII与EcoRI限制酶消化作用确认五种构建体，并以1％琼脂糖凝胶分析。正确的构建体应释放约1.67kb的CRM197基因片段。进一步将第3-14号构建体送交DNA测序并以正确的CRM197编码序列确认。图4显示了CRM197表达的SDS-PAGE分析。(A)将来自图3的CRM197第3-14号构建体转化至感受态细胞BL21中并筛选CRM197表达。在相同表达条件下检查六个转化物。以10％SDS-PAGE分析相同量的总可溶形式蛋白质(6μg)。在58kDa处观察到强诱导的蛋白质条带。显示所有这些转化物具有相当的CRM197表达。选择第3-14-8号菌株用于进一步进行蛋白质品质分析。(B)温育28及45小时后PelB-CRM197的周质表达。箭头指示为CRM197融合蛋白质。图5显示了在各种培养基中，大肠杆菌BL21菌株中与PelB信号序列融合的CRM197的表达。图6显示了在各种pH值下，在大肠杆菌BL21菌株中与PelB信号序列融合的CRM197的表达。图7显示了重组pelBss-CRM197切割位点分析的结果。(A)CRM197的RP-HPLC图谱分析。将来自第3-14-8号表达菌株的一步DEAE纯化的CRM197进行LC-MS分析，以确认PelB信号序列以及CRM197之间的切割位点。上述结果显示，从两批样品(以phoA与MTB作为基础培养基)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生CRM197蛋白质的方法，包括：/n培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细胞，其中该多核苷酸包含：/n(a)与SEQ ID NO:1至少90％相同的CRM197核苷酸序列，以及/n(b)分泌信号序列，其于该CRM197核苷酸序列的5’端编码SEQ ID NO:2的氨基酸；以及/n诱导该CRM197蛋白质的表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180119 US 62/619,4491.一种产生CRM197蛋白质的方法，包括：
培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细胞，其中该多核苷酸包含：
(a)与SEQIDNO:1至少90％相同的CRM197核苷酸序列，以及
(b)分泌信号序列，其于该CRM197核苷酸序列的5’端编码SEQIDNO:2的氨基酸；以及
诱导该CRM197蛋白质的表达。


2.如权利要求1所述的方法，其中该分泌信号序列为果胶酸裂解酶B(PelB)序列。


3.如权利要求2所述的方法，其中该PelB序列来自欧文氏菌属种。


4.如权利要求1所述的方法，其中该表达质粒包含磷酸盐调节的启动子。


5.如权利要求4所述的方法，其中该磷酸盐调节的启动子为细菌的碱性磷酸酶A启动子。


6.如权利要求1所述的方法，其中该细胞包含大肠杆菌。


7.如权利要求1所述的方法，其中该CRM197蛋白质为可溶性的。


8.如权利要求1所述的方法，其中该CRM197蛋白质为周质的。


9.如权利要求1所述的方法，其中该CRM197蛋白质被折叠并包含内二硫键。


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【专利技术属性】
技术研发人员：刘理成，卓逸明，邱家鸿，
申请(专利权)人：台湾浩鼎生技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71