心脏、骨骼肌和肌肉干细胞中的体内同源性定向修复制造技术

公开了使用通过病毒递送的靶向序列的核酸酶和供体序列对骨骼肌和心肌进行基因组修饰的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】心脏、骨骼肌和肌肉干细胞中的体内同源性定向修复相关申请本申请要求2018年5月3日提交的美国临时申请序列号62/666,685的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术介绍
靶向序列的核酸酶诸如CRISPR/Cas9通过参与DNA双链断裂(DSB)修复的细胞机制，提供强大的工具来编辑哺乳动物基因组。非同源末端连接(NHEJ)和同源性定向修复(HDR)是细胞修补核酸酶产生的DSB并防止基因组损伤和细胞死亡所用的主要途径。虽然NHEJ在整个细胞周期和非分裂细胞中均有活性，但由于高度不可预测的核苷酸插入和缺失，这种容易出错的途径会产生可变的序列结果。相反，HDR提供更精确的基因编辑结果，以及引入全新序列元件的独特能力，但通常认为HDR在有丝分裂后器官中的效率低下，并且需要存在于内源染色体或外源模板上的同源DNA。虽然最近的研究已经研究了CRISPR诱导的HDR在培养的细胞、受精卵中以及局部递送到特定组织中的用途，但尚未测试在出生后的哺乳动物中实现体内多器官HDR的可行性。此外，尚待探索是否可以在再生干细胞中实现体内HDR靶向，从而提供经编辑的细胞库来支持正在进行的组织更新和修复。
技术实现思路
专利技术人惊奇且意外地发现，小鼠出生后的心肌、骨骼肌和肌肉干细胞在不同发育时间点经受模板化的同源性定向修复(HDR，也称为同源重组)。这为通过HDR在骨骼肌和心肌中进行精确、靶向的基因替换提供了意外的机会，这两种主要的有丝分裂后组织一直被广泛认为无法通过这种方法获得。据我们所知，此数据通过CRISPR/Cas9的全身性AAV递送，首次证明了在出生后的心脏中显著进行体内HDR编辑，并且代表比先前报道的通过局部、肌肉内递送在骨骼肌中可实现的HDR编辑率的实质性改善。本文所述的专利技术还首次证明了组织干细胞在其天然生态位内成功进行HDR编辑，这将独特地实现在治疗上和实验上定向操作干细胞基因组，而无需分离、扩增或移植这些稀有细胞。最终，在新生的哺乳动物心脏和出生后的哺乳动物骨骼肌卫星细胞中刻入不可逆且可能持久的精确基因组修饰的能力为包括杜兴氏肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy)(DMD)在内的许多目前难治的心脏疾病和肌肉疾病的未来治疗性干预开辟了令人兴奋的新途径。本专利技术的一些方面涉及在受试者体内(例如，在肌肉前体生态位中)修饰肌肉前体细胞的基因组的方法，其包括使所述肌肉细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒在所述肌肉前体细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在所述肌肉前体细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个(例如，一个或两个)gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)或其功能片段。在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用肌肉前体细胞特异性启动子、组成型启动子或遍在型启动子来转导。在一些实施方案中，编码供体模板和任选地一个或多个gRNA的核酸序列使用U6启动子或H1启动子来转导。在一些实施方案中，所述肌肉前体细胞是肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述受试者中至少1％的肌肉前体细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述修饰是一个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述修饰是两个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述受试者(例如，人类或小鼠)不是婴儿或幼年或30岁以下。在一些实施方案中，所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。在一些实施方案中，向所述受试者全身性施用所述病毒或通过肌肉内注射来施用所述病毒。本公开的一些方面涉及包含具有通过本文公开的方法修饰的基因组的核(例如，肌核)的肌纤维。本公开的一些方面涉及在受试者体内修饰心脏细胞的基因组的方法，其包括使所述心脏细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒在心脏细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在心脏细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入，并且其中所述心脏细胞是DNA合成的心脏细胞或复制的心脏细胞。在一些实施方案中，所述心脏细胞选自由哺乳动物有丝分裂后心肌细胞、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的哺乳动物有丝分裂后心肌细胞、人类有丝分裂后心肌细胞、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的人类有丝分裂后心肌细胞、心肌细胞前体细胞、增殖的间充质心脏细胞、增殖的内皮心脏细胞和心脏祖细胞组成的组。在一些实施方案中，所述受试者(例如，人类或小鼠)是婴儿或幼年或30岁以下的人(如果是人类)。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)或其功能片段。在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用心脏特异性启动子、遍在型启动子或非特异性启动子来转导。在一些实施方案中，所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。在一些实施方案中，所述受试者中至少1.6％的心肌细胞被修饰。本公开的一些方面涉及包含通过本文公开的方法修饰的心肌细胞的心脏组织。本公开的一些方面涉及通过同源性定向修复在受试者体内靶向特定横纹肌类型进行基因组修饰的方法，其包括使用一种或多种病毒全身性施用，其中所述一种或多种病毒在横纹肌细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在横纹肌细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入，并且其中，由于所述受试者的年龄，基因组修饰优先发生在至少一种类型的横纹肌上。在一些实施方案中，肌肉细胞(例如肌肉祖细胞)的基因组被优先修饰。在一些实施方案中，心脏细胞(例如，增殖的或DNA合成的心脏细胞)的基因组被优先修饰。参考本专利技术的以下详细描述，本专利技术的上文讨论的以及许多其他特征和伴随的优点将变得更好理解。附图说明本专利或申请文件包含至少一张彩绘附图。根据要求并支付必需费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。图1A-图1J示出了GFP/BFP颜色转换报告系统，其能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在受试者体内修饰肌肉前体细胞的基因组的方法，其包括使所述肌肉细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒/na.在所述肌肉前体细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并/nb.在所述肌肉前体细胞中转导供体模板，/n其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180503 US 62/666,6851.一种在受试者体内修饰肌肉前体细胞的基因组的方法，其包括使所述肌肉细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒
a.在所述肌肉前体细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并
b.在所述肌肉前体细胞中转导供体模板，
其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。


3.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。


4.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个gRNA的第二病毒。


5.如权利要求1-4所述的方法，其中所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶或其功能片段或功能变体。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas9核酸酶。


7.如权利要求1-6所述的方法，其中所述编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用肌肉前体细胞特异性启动子、组成型启动子或遍在型启动子来转导。


8.如权利要求1-7所述的方法，其中所述编码供体模板和任选地一个或多个gRNA的核酸序列使用U6启动子或H1启动子来转导。


9.如权利要求1-8所述的方法，其中所述肌肉前体细胞是肌肉干细胞。


10.如权利要求1-9所述的方法，其中所述受试者中至少1％的肌肉前体细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。


11.如权利要求1-9所述的方法，其中所述受试者中至少40％的肌肉前体细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。


12.如权利要求1-11所述的方法，其中所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。


13.如权利要求1-12所述的方法，其中所述受试者是幼年。


14.如权利要求1-13所述的方法，其中向所述受试者全身性施用所述病毒。


15.一种肌纤维，其包含具有通过如权利要求1-14所述的方法修饰的基因组的肌核。


16.一种在受试者体内修饰心脏细胞的基因组的方法，其包括使所述心脏细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒
a.在所述心脏细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并
b.在所述心脏细胞中转导供体模板，...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾米·J·韦格斯，朱克先，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，
类型：发明
国别省市：美国;US