一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法，使用三氯甲烷浸提蓝莓,氮吹后，用BSTFA(N,O‑双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)和吡啶进行衍生化反应，再上样进行GC‑MS检测；进行定量过滤，采用金属浴进行衍生化，改进了气相色谱质谱检测过程的升温过程，形成了一套新的蓝莓蜡质提取与检测的方法；具体的步骤包括计算蓝莓果实的表面积；通过浸提法将蜡质从蓝莓果实上溶解下来；对蜡质进行衍生化；使用气相色谱质谱联用仪(7890A GC,5975MS,Agilent Technologies,U.S.A.)测定蜡质的各组分和含量。通过上述设置，能够更加充分的提取蓝莓果实表皮蜡质，更加容易分离检测到蜡质混合物的各组分并得到其含量。

【技术实现步骤摘要】
一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法
本专利技术涉及蓝莓种植领域，具体为一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法。
技术介绍
蓝莓果实表皮有一层白色的由表皮薄壁细胞分泌合成的次生代谢产物组成的疏水结构层，叫做蜡质。它是蓝莓果实抵抗非生物和生物侵染第一道天然屏障，在帮助蓝莓适应不利环境和保证自身生长、发育等方面具有重要作用，可以隔绝病原微生物和虫害，防止紫外线伤害、减轻机械损伤，减少水分散失，限制内部组织物质的损失，防止物理、化学和生物攻击，并提供机械支持以维持植物器官的完整性，在改善蓝莓果实品质、延长贮藏保鲜期和提高采后病原菌抗性等方面也起着重要作用。蓝莓果实表皮蜡质的提取和检测对研究蜡质与果实生理代谢相关性具有重要意义。常用的表皮蜡质提取方法有直接浸提法和酶提法，酶提法操作复杂且需要一定温度环境，在果实中常采用的是直接浸提法。在以下的文献中，《ChangesinCuticularWaxCompositionofTwoBlueberryCultivarsduringFruitRipeningandPostharvestColdStorage》,J.Agric.FoodChem.2018,66,2870-2876，楚文靖等使用三氯甲烷液浸提蓝莓1min,氮吹之后再用BSTFA和吡啶进行衍生化反应，最后上样进行GC-MS检测。然而，该方法对于蜡质的提取仍然存在一定的改进空间，因此进行改进，并提出本申请。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法，其能够更加充分的提取蓝莓果实表皮蜡质，更加容易分离检测到蜡质混合物的各组分并得到其含量。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法,包括以下步骤：S1、计算蓝莓果实表面积：用游标卡尺测量蓝莓果实赤道部位直径d、高度h，其中d和h的单位为cm，单个蓝莓果实的表面积S1＝π*(d+h)2/4；S2、溶解蜡质：S2.1、将20个大小均匀、无病虫害、表面无损伤的蓝莓果实置于烧杯中，加入20mL三氯甲烷，常温轻摇提取2次，每次1min，彻底溶解表皮蜡质层，3次重复；S2.2、溶有蜡质的氯仿溶液通过直径9cm的中速定量滤纸过滤于试管中，试管的初始质量为m0，单位为μg；S2.3、使用氮吹仪，恒温水浴40℃，在恒定流速8L/min的氮气流下将带有蜡质的溶液蒸发至干，对试管和干燥的样品进行称量，质量记为m1，单位为μg；S2.4、蓝莓果实表皮总蜡质含量的计算公式如下：蜡质含量L＝(m1-m0)/S，其中L的单位为μg/cm2，S为20个蓝莓的总表面积即20*S1；S3、蜡质衍生化：S3.1、在稳定的氮气流下加入100μLN,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和100μL吡啶，立即用封口膜包住试管口，此步操作注意严格防水；S3.2、金属浴70℃条件下保持40分钟，期间每隔十分钟涡旋震荡试管底部蜡质，使试管中的蜡质充分进行衍生化反应；S3.3、反应完成后，在恒定流速6L/min氮吹下吹干N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺溶液，待试管冷却至室温；S3.4、加入1mL三氯甲烷溶液重新溶解衍生化后的蜡质，再加入100μL正二十四烷内标溶液，震荡混匀；S3.5、一次性注射器吸取混匀后的溶液，用直径13mm、孔径0.20μm的一次性有机系滤器过滤至2.0mL棕色自动进样瓶中，瓶中提前装好玻璃质材的内插管；S4、使用气相色谱-质谱联用仪测定蜡质组分。优选的，步骤S4包含以下内容：S4.1、初始条件：使用气相色谱质谱联用仪，采用通用型毛细管柱HP-5；自动进样量1μL，分流比为2:1；色谱条件为：前进样口温度250℃，质谱源温度230℃，Aux-2温度280℃，色谱柱恒定流速1mL·min-1，质谱条件为：以He作为载气，气流速15mL·min-1，开始等待时间1min；进样口压力60.732kPa，电子轰击电离方式，能量70eV，质量扫描范围50-720amu，全扫描方式，溶剂延迟3min；升温过程：70℃保持2min，以6℃·min-1升温至190℃，保持3min；以5℃·min-1升温至270℃，保持3min，再以,3℃·min-1升温至290℃，保持5min，最后以2℃·min-1升温至300℃，保持5min；S4.2、各种蜡质成分经GC-MS检测后得到其离子峰，依据质谱库进行检索判定，并按一定的条件对离子峰进行面积积分，确定并分纳物质的归类，以内标法定量计算蜡质各组分浓度，结合峰面积归一化法计算各组分相对质量分数。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)更改三氯甲烷的浸提时间，能够更加充分的将蓝莓果实表面的蜡质进行溶解，从而能够增加结果的准确性；(2)通过定量过滤过滤纸进行过滤，能够保证蜡质不会在操作过程中流失，进而更加保障蜡质能够充分的被提取出来；(3)使用金属浴进行衍生化，能够使得提取出的蜡质成分充分的衍生化，从而能够使得蜡质中的各个组分衍生为能被气相色谱质谱联用仪充分检测出来的物质形态；(4)减少了分流比，从而增加进入柱子的样品量，使检测结果峰值明显增高，微量的物质也能被软件充分检测出来；(5)增大扫描离子范围，从而使蜡质混合物检测结果充分匹配到候选有机物；(6)改善气相色谱质谱联用仪检测蓝莓蜡质样品的升温程序，能够使检测结果色谱图的各个峰完全分离，从而能够更精确的计算峰面积，得到各组分占总蜡质含量的百分比。附图说明图1为本专利技术中蓝莓果实表皮蜡质GC-MS色谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，本专利技术提供的一种实施例：一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法,包括以下步骤：S1、计算蓝莓果实表面积：用游标卡尺测量蓝莓果实赤道部位直径d、高度h，其中d和h的单位为cm，单个蓝莓果实的表面积S1＝π*(d+h)2/4；S2、溶解蜡质：S2.1、将20个大小均匀、无病虫害、表面无损伤的蓝莓果实置于烧杯中，加入20mL三氯甲烷，常温轻摇提取2次，每次1min，彻底溶解表皮蜡质层，3次重复；S2.2、溶有蜡质的氯仿溶液通过直径9cm的中速定量滤纸过滤于试管中，试管的初始质量为m0，单位为μg；S2.3、使用氮吹仪(N-EVAP-111,OrganomationAssociates,Jns.U.S.A.)，恒温水浴40℃，在恒定流速8L/min的氮气流下将带有蜡质的溶液蒸发至干，对试管和干燥的样品进行称量，质量记为m1，单位为μg；S2.4、蓝莓果实表皮总蜡质含量的计算公式如下：蜡质含量L＝(m1-m0)/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、计算蓝莓果实表面积：用游标卡尺测量蓝莓果实赤道部位直径d、高度h，其中d和h的单位为cm，单个蓝莓果实的表面积S

【技术特征摘要】
1.一种蓝莓果实表皮蜡质的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、计算蓝莓果实表面积：用游标卡尺测量蓝莓果实赤道部位直径d、高度h，其中d和h的单位为cm，单个蓝莓果实的表面积S1＝π*(d+h)2/4；
S2、溶解蜡质：
S2.1、将20个大小均匀、无病虫害、表面无损伤的蓝莓果实置于烧杯中，加入20mL三氯甲烷，常温轻摇提取2次，每次1min，彻底溶解表皮蜡质层，3次重复；
S2.2、溶有蜡质的氯仿溶液通过直径9cm的中速定量滤纸过滤于试管中，试管的初始质量为m0，单位为μg；
S2.3、使用氮吹仪，恒温水浴40℃，在恒定流速8L/min的氮气流下将带有蜡质的溶液蒸发至干，对试管和干燥的样品进行称量，质量记为m1，单位为μg；
S2.4、蓝莓果实表皮总蜡质含量的计算公式如下：蜡质含量L＝(m1-m0)/S，其中L的单位为μg/cm2，S为20个蓝莓的总表面积即20*S1；
S3、蜡质衍生化：
S3.1、在稳定的氮气流下加入100μLN,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和100μL吡啶，立即用封口膜包住试管口，此步操作注意严格防水；
S3.2、金属浴70℃条件下保持40分钟，期间每隔十分钟涡旋震荡试管底部蜡质，使试管中的蜡质充分进行衍生化反应；
S3.3、反应完成后，在恒定流速6L/min氮吹下吹干N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺溶液，待试管冷却至室温；
S3.4、加入1mL三氯甲烷溶液重新溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑伟尉，曹亚茹，臧运祥，徐凯，高永彬，吴伯萍，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33