基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于RAA‑LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物及应用，扩增引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，上游引物及下游引物的5’端分别用荧光素和生物素类化合物标记。试剂盒中含有如上所述的扩增引物对。本发明专利技术将RAA技术与侧流层析试纸条结合，实现了金黄色葡萄球菌的准确高效检测。本发明专利技术的扩增引物，特异性强，灵敏度高，可重复性好；检测方法简单、快捷、方便、特异性强且灵敏度高，极具应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物及应用
本专利技术属于分子生物学检测
，涉及一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物及应用，特别涉及一种用于快速检测金黄色葡萄球菌的RAA-LF引物、由其制成的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
奶牛乳房炎(BovineMastitis,BM)是世界范围内最常见的奶牛疾病，严重影响感染动物的健康和福利。有研究表明，全世界每年因奶牛乳房炎造成的经济损失高达350亿美元，美国、英国和日本等国家奶牛乳房炎发病率达50％左右，而我国的奶牛乳房炎发病率高达70％左右，对奶牛饲养管理产生了较大的影响。奶牛乳房炎主要是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所产生的一种炎症反应。而微生物的入侵是不可忽略的因素，其中以接触性致病菌为代表的金黄色葡萄球菌是主要病原之一。在现代化、集约化规模的奶牛场中，及时、准确地鉴别致病菌，对能否有效防控乳房炎并获得好的治疗效果以及实现最大限度的降低经济损失有直接影响。目前用于奶牛乳房炎病原菌诊断的方法有常规微生物生化鉴定法、全自动微生物鉴定系统、16SrRNA基因序列测序、PCR、基因芯片以及环介导等温扩增技术等。传统的检测方法繁琐操作步骤，耗时费力，不能满足检测的现场实施。基因芯片技术和环介导等温扩增技术存在成本高昂、重复性差且易出现假阳性结果等缺点。PCR检测试剂仪器成本昂贵；且需精密检测设备和严格操作流程；无法满足现场快速检测和大规模监测的需求，限制其在基层单位的应用。核酸等温扩增技术的出现有效弥补了现有分子检测方法的不足，扩大了核酸检测技术应用范围，在保证高灵敏度和高特异性的基础上，向快速、低成本、微型化的方向发展，并逐渐成为致病菌核酸检测领域的研究热点。目前RAA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中。CN110564881A公开了一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法，首次将RAA-LF用于检测病原体，为检测病原体提供了一种全新的思路。但是，RAA方法在牛源性金黄色葡萄球菌检测的相关研究还处于空白阶段，检测金黄色葡萄球菌的RAA方法的研究难点在于基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物的开发，在样品中不仅可能包含金黄色葡萄球菌而且还包括很多其他菌种如大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌等，如何能够保证引物的特异性及扩增速度这是困扰本领域技术人员的核心问题。因此，开发一种能够在现场快速检测金黄色葡萄球菌的RAA方法极具现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术检测速度较慢且无法在现场完成检测的缺陷，提供一种能够在现场快速检测金黄色葡萄球菌的RAA方法，具体为提供了一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，该引物对金黄色葡萄球菌的特异性好，其扩增速度快，灵敏度高，实现了金黄色葡萄球菌的现场快速检测，极大地降低了金黄色葡萄球菌快速检测的硬件限制(只需一台恒温设备即可在现场完成检测)，极具应用前景。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，上游引物和下游引物分别含有如下所示的核苷酸序列：F(上游引物)：5’-GACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGA-3’；R(下游引物)：5’-TTCACTTTTTCTTAAAAGTTGTTCATGTGT-3’。本专利技术的基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，是通过针对金黄色葡萄球菌的特异性基因保守区域实现扩增的，这能够保证引物的特异性，进而避免后期对金黄色葡萄球菌进行检验时其他菌种的影响，同时本专利技术对扩增引物进行了特定的选择以保证引物的扩增速度(灵敏度)。作为优选的技术方案：如上所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，上游引物和下游引物的核苷酸序列为：F：5’-GACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGA-3’；R：5’-TTCACTTTTTCTTAAAAGTTGTTCATGTGT-3’。如上所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，上游引物及下游引物的5’端分别用荧光素和生物素类化合物标记。本专利技术的保护范围并不仅限于此，具体的标记物本领域技术人员可根据实际情况进行选择，此处仅给出一种可行的技术方案而已。如上所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，所述荧光素为羧基荧光素6-FAM；所述生物素类化合物为生物素Biotin。本专利技术的保护范围并不仅限于此，本领域技术人员可根据实际需求选择合适的荧光素和生物素类化合物。如上所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，所述金黄色葡萄球菌为牛源性金黄色葡萄球菌，本专利技术的扩增引物并不仅仅限于牛源性金黄色葡萄球菌，也可能适用于其他金黄色葡萄球菌，本专利技术对牛源性金黄色葡萄球菌进行了相关验证，并提供了其对牛源性金黄色葡萄球菌的最佳扩增条件，其他金黄色葡萄球菌的具体扩增条件可能与本专利技术给出的条件不同。本专利技术还提供了一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌检测试剂盒，所述试剂盒中含有如上所述的扩增引物对。作为优选的技术方案：如上所述的基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌检测试剂盒，还包括RAA反应试剂盒和侧流层析试纸条。此外，金黄色葡萄球菌检测试剂盒还可配套设置金黄色葡萄球菌nuc基因阳性对照样品和阴性对照样品，通过金黄色葡萄球菌nuc基因阳性对照样品和阴性对照样品能够极大地方便操作人员进行比对。如上所述的基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌检测试剂盒，所述RAA反应试剂盒包括含冻干酶粉的反应管、基础缓冲液、无菌去离子水以及醋酸镁，其他RAA反应必需的物品包括在RAA反应试剂盒内。本专利技术还提供了一种金黄色葡萄球菌的RAA-LF检测方法，步骤如下：(1)提取待测样品的DNA；(2)将如上所述的引物和步骤(1)获取的待测样品的DNA配制得到RAA反应体系，RAA反应体系在33℃下恒温RAA扩增反应20～30min；(3)取步骤(2)获取的RAA扩增产物滴加到侧流层析试纸条的加样区，将侧流层析试纸条加样区的末端垂直插入含有LF缓冲液的离心管中，5～10min后取出侧流层析试纸条进行观察并记录结果；如侧流层析试纸条在质控线和检测线位置均有条带，待测样品含有金黄色葡萄球菌；如侧流层析试纸条在质控线位置有条带且在检测线位置没有条带，待测样品不含有金黄色葡萄球菌，或待测样品中金黄色葡萄球菌的含量低于最低检出量；如侧流层析试纸条在质控线和检测线位置均没有条带，侧流层析试纸条失效需重新检测。本专利技术的金黄色葡萄球菌的RAA-LF检测方法，整体操作简便，实验条件低(仅需恒温环境)，所需时间短，通过肉眼即可直接确认测试结果，实现了金黄色葡萄球菌的现场快速检测，极大地降低了金黄色葡萄球菌快速检测的硬件限制(只需一台恒温设备即可在现场完成检测)，极具应用前景。作为优选的技术方案：如上所述的一种金黄色葡萄球菌的RAA-LF检测方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，其特征在于，上游引物和下游引物分别含有如下所示的核苷酸序列：/nF：5’-GACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGA-3’；/nR：5’-TTCACTTTTTCTTAAAAGTTGTTCATGTGT-3’。/n

【技术特征摘要】
20200806 CN 20201078366301.一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，其特征在于，上游引物和下游引物分别含有如下所示的核苷酸序列：
F：5’-GACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGA-3’；
R：5’-TTCACTTTTTCTTAAAAGTTGTTCATGTGT-3’。


2.根据权利要求1所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，其特征在于，上游引物和下游引物的核苷酸序列为：
F：5’-GACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGA-3’；
R：5’-TTCACTTTTTCTTAAAAGTTGTTCATGTGT-3’。


3.根据权利要求1或2所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，其特征在于，上游引物与下游引物的5’端分别用荧光素和生物素类化合物标记。


4.根据权利要求3所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，其特征在于，所述荧光素为羧基荧光素6-FAM，生物素类化合物为Biotin。


5.根据权利要求1所述的一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌扩增引物，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌为牛源性金黄色葡萄球菌。


6.一种基于RAA-LF技术的金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求1或2所述的扩增引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓红，后来旺，李达容，赵勇，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31