一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法技术

本申请公开了一种用于定量检测BCR‑ABL融合基因的引物和探针组合，包括用于特异性扩增BCR‑ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针；所述特异性引物对包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物，所述特异性探针为Seq ID No.3所示序列；所述内标引物对包括Seq ID No.4所示序列的上游引物和Seq ID No.5所示序列的下游引物，所述内标探针为Seq ID No.6所示序列；所述特异性引物对和特异性探针以及所述内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR‑ABL融合基因模板。本申请提供的引物和探针组合，能够对BCR‑ABL融合基因模板分别进行扩增，并实现分别建立BCR‑ABL融合基因和ABL基因两套标准曲线，从而实现对样本中BCR‑ABL和ABL的比值进行定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
本申请涉及基因突变检测领域，具体涉及一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
慢性髓系白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增殖肿瘤，占所有白血病的15％-20％，全世界年发病率(1.0-1.5)/10万，临床上分慢性期(chronicphase,CP)、加速期(acceleratedphase,AP)、和急变期(blasticphase,BP或blastcrisis,BC)。95％以上的CML患者存在特征性的遗传学异常，即细胞中含有异常的染色体——费城染色体Ph(Philadelphiachromosome)，费城染色体是由位于第9号染色体长臂远端的白血病原癌基因ABL易位至第22号染色体BCR基因的断裂点形成的，在分子水平上产生了BCR-ABL融合基因，其编码的蛋白主要是P210，具有酪氨酸激酶活性，可导致持续且异常活化的酪氨酸激酶，干扰细胞的正常增殖和凋亡程序，导致白血病的发生。据统计，在CML患者中，BCR-ABL融合基因阳性率为99％。目前对CML患者的治疗已从传统的姑息性治疗、化疗发展到使用特异的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,TKI)进行分子靶向治疗。研究表明，BCR-ABL融合基因的表达水平与TKI临床疗效有很好的相关性，并且能预先对临床病情变化提出警示，对于肿瘤微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义，因此，定期检测BCR-ABL融合基因的表达水平至关重要。美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的《CML临床实践指南》(2012版)明确将P210检测作为慢粒白血病患者初筛和酪氨酸激酶抑制剂疗效跟踪的预后指标，并提出了更早的治疗方案决策时间点(3个月)，同时建议IM治疗3个月内未实现BCR-ABL/ABL≤10％的患者，换用第二代TKI药物，考虑异基因造血干细胞移植或临床试验，并停用IM。目前，可以利用荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因的含量，监测CML患者的TKI用药治疗过程，但是原位杂交实验操作复杂，若样本处理不当则难以检出。另一方面，荧光原位杂交方法需要进行骨髓穿刺活检来获得可培养的中期细胞，实验耗时长，对技术要求高，患者痛苦大，适用于初诊和复发的检测，无法作为持续监测和预后观察的方法长期使用。此外，也有研究通过实时定量PCR方法和逆转录技术结合，采用一步法检测样本中BCR-ABL融合基因的表达水平，并采用两套参考品标准曲线对目的基因和内参基因进行分别定量以达到对BCR-ABL融合基因定量检测的目的。然而，现有检测BCR-ABL融合基因的方法均只能对BCR-ABL融合基因进行定量，而无法对BCR-ABL和ABL的比值进行定量。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的第一方面公开了一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合，其特征在于，包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针；特异性引物对包括SeqIDNo.1所示序列的上游引物和SeqIDNo.2所示序列的下游引物，特异性探针为SeqIDNo.3所示序列；内标引物对包括SeqIDNo.4所示序列的上游引物和SeqIDNo.5所示序列的下游引物，内标探针为SeqIDNo.6所示序列；SeqIDNo.1：5’-TTCCGCTGACCATCAATAAGG-3’SeqIDNo.2：5’-CTTCACTCAGACCCTGAGGCT-3’SeqIDNo.3：5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’SeqIDNo.4：5’-GGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGA-3’SeqIDNo.5：5’-ATGTAGTTGCTTGGGACCCAG-3’SeqIDNo.6：5’-TTGGCCATTTTTGGTTTGGGCTTCACA-3’；其中，SeqIDNo.3所示序列的探针和SeqIDNo.6所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰，3’端具有荧光淬灭基团修饰，SeqIDNo.6所示序列的探针和SeqIDNo.3所示序列的探针的5’端修饰的荧光基团相同；特异性引物对和特异性探针以及内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR-ABL融合基因模板。需要说明的是，本申请通过用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针分别对相同的BCR-ABL融合基因模板进行扩增，能够实现根据一套BCR-ABL融合基因模板建立BCR-ABL融合基因和ABL基因两套标准曲线，并对样本中BCR-ABL和ABL的比值进行定量检测。本申请的第二方面公开了一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，包括上述引物和探针组合。本申请的一种实现方式中，试剂盒还包括逆转录试剂、内参试剂、定量标准品；内参试剂包括阳性参考品、阴性参考品和国际单位换算参考品；阳性参考品和国际单位换算参考品分别含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA按不同比值混合的混合物。需要说明的是，本申请通过国际单位换算参考品将BCR-ABL和ABL的比值溯源到国际单位标准品，从而在监测CML患者TKI用药治疗过程中，根据溯源到国际单位标准品BCR-ABL和ABL的比值，能够参照国际标准对CML患者TKI用药治疗过程指进行分级指导，确定MMR分级治疗方案。本申请的一种实现方式中，阳性参考品中含有强阳性参考品和弱阳性参考品，强阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值大于弱阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值，国际单位换算参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值溯源到国际单位标准品；优选地，强阳性参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为1.5％的混合物；弱阳性参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为0.0005％的混合物；国际单位换算参考品中含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值为0.015％的混合物。需要说明的是，本申请采用BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA比值不同的混合物作为多个阳性参考品，既能够用于判断高浓度BCR-ABL融合基因的待测样本是否能有效扩增，也能够用于判断低浓度BCR-ABL融合基因的待测样本是否有效进行反应，因而能够监测不同浓度BCR-ABL融合基因的PCR扩增反应的有效性，同时还能将BCR-ABL和AB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合，其特征在于，包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针；/n所述特异性引物对包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物，所述特异性探针为Seq ID No.3所示序列；所述内标引物对包括Seq ID No.4所示序列的上游引物和Seq ID No.5所示序列的下游引物，所述内标探针为Seq ID No.6所示序列；/nSeq ID No.1：5’-TTCCGCTGACCATCAATAAGG-3’/nSeq ID No.2：5’-CTTCACTCAGACCCTGAGGCT-3’/nSeq ID No.3：5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’/nSeq ID No.4：5’-GGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGA-3’/nSeq ID No.5：5’-ATGTAGTTGCTTGGGACCCAG-3’/nSeq ID No.6：5’-TTGGCCATTTTTGGTTTGGGCTTCACA-3’；/n其中，所述Seq ID No.3所示序列的探针和所述Seq ID No.6所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰，3’端具有荧光淬灭基团修饰，所述Seq ID No.6所示序列的探针和所述Seq ID No.3所示序列的探针的5’端修饰的荧光基团相同；/n所述特异性引物对和特异性探针以及所述内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR-ABL融合基因模板。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的引物和探针组合，其特征在于，包括用于特异性扩增BCR-ABL融合基因的特异性引物对和特异性探针以及用于特异性扩增ABL基因的内标引物对和内标探针；
所述特异性引物对包括SeqIDNo.1所示序列的上游引物和SeqIDNo.2所示序列的下游引物，所述特异性探针为SeqIDNo.3所示序列；所述内标引物对包括SeqIDNo.4所示序列的上游引物和SeqIDNo.5所示序列的下游引物，所述内标探针为SeqIDNo.6所示序列；
SeqIDNo.1：5’-TTCCGCTGACCATCAATAAGG-3’
SeqIDNo.2：5’-CTTCACTCAGACCCTGAGGCT-3’
SeqIDNo.3：5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’
SeqIDNo.4：5’-GGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGA-3’
SeqIDNo.5：5’-ATGTAGTTGCTTGGGACCCAG-3’
SeqIDNo.6：5’-TTGGCCATTTTTGGTTTGGGCTTCACA-3’；
其中，所述SeqIDNo.3所示序列的探针和所述SeqIDNo.6所示序列的探针的5’端具有荧光基团修饰，3’端具有荧光淬灭基团修饰，所述SeqIDNo.6所示序列的探针和所述SeqIDNo.3所示序列的探针的5’端修饰的荧光基团相同；
所述特异性引物对和特异性探针以及所述内标引物对和内标探针用于扩增相同的BCR-ABL融合基因模板。


2.一种用于定量检测BCR-ABL融合基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和探针组合。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录试剂、内参试剂、定量标准品；所述内参试剂包括阳性参考品、阴性参考品和国际单位换算参考品；所述阳性参考品和所述国际单位换算参考品分别含有BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA按不同比值混合的混合物。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性参考品包括强阳性参考品和弱阳性参考品，所述强阳性参考品中BCR-ABL融合基因细胞RNA和非融合基因细胞RNA的比值大于弱阳性参考品中B...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄絮，彭进，
申请(专利权)人：凯杰生物工程深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44