一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒，靶标核酸分子的检测方法包括向含有待检靶标核酸分子的反应体系中加入向导RNA、Cas12a、核酸探针，反应完成后对其进行检测。使用本发明专利技术的方法可快速检测样品中是否含有靶标核酸序列。通过与核酸扩增技术的结合，该检测方法的灵敏度可以得到大幅度提高。根据该方法的特点，将其命名为HOLMES(one HOur Low‑cost Multiplex Efficient Simple assay)，即一小时、低成本、多通道、高效、简单的分析方法,该方法可用于快速检测病原微生物、基因突变和特异靶标DNA等。

【技术实现步骤摘要】
一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒本案是申请日为2017年7月14日、申请号为CN201710573752.0、专利技术名称为“一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒”的中国专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种用于靶标核酸分子检测的方法。
技术介绍
特异性检测核酸分子(Nucleicaciddetection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleicaciddiagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要意义(O’ConnorandGlynn2010,Scheler,Glynnetal.2014)。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotidepolymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。目前已建立了不少NADs的方法，主要是针对特异性DNA分子的检测，也有部分方法针对RNA分子。通常来说，DNA分子非常稳定，因此检测样品可来源于一系列复杂的生物样本；而RNA则非常容易降解，因此处理时需要非常小心。在上世纪70年代，建立了限制性内切酶酶切检测的方法，后来又发展了Southern、Northern和斑点杂交等方法进行特异性检测核酸分子检测。1985年，当PCR方法成为常规实验方法后，导致了分子生物学指数级的进步。目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。PCR技术是最先建立也是目前最常用的扩增方法，目前在PCR方法基础上，引入了荧光标记的探针，可以实时检测靶标的扩增情况，称为RealtimePCR。RealtimePCR不仅是快速、高灵敏的检测方法，同时这种方法也可以进行定量分析。除了PCR的扩增方法，还建立了许多替代方法，比如ligasechainreaction,branchedDNAamplification,NASBA,SDA,transcription-mediatedamplification,loopmediatedamplification,rollingcircleamplificationandTwistAmpTM等。许多这些替代方法的优势在于等温性，也就是说只需要一个温度即可以完成反应，而不需要像PCR那样的热循环仪器。核酸检测的方法除了RealtimePCR可以直接完成扩增和检测之外，FISH杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization)是最常用的检测方法，通过标记分子探针，原位与互补的靶标序列杂交。除此之外，目前还开发了biosensors,nanopores和next-generationsequencingtechnologies等检测方法，但这些方法通常需要昂贵的实验设备。对SNPs的检测首先同样需要进行PCR等方法的扩增，从而获得足量的含SNP位点区域片段进行进一步的检测。比较常用的方法有：引物延伸(primerextension)，杂交(hybridization)，连接(ligation)和酶切(enzymaticcleavage)。当完成上述方法之后，需要进行特定的方法检测，比如质谱检测、荧光检测、化学发光检测等。核酸检测虽然如上文所述已开发出了不少检测方法，但是在某些情况下，如何更加快速、简便、廉价的检测是重要的发展方向，比如在野外的病原菌快速检测、药物敏感SNP快速检测等。在2016年，Collins等基于CRISPR-Cas9特异性识别并切割靶标序列的特点，开发了快速廉价检测寨卡病毒(Zika)的方法。2017年，张锋等利用CRISPR-Cas13a具有“旁路活性”(collateraleffect)的特点建立了快速核酸探测的方法，即Cas13a结合特异性靶标RNA后随即切割其他RNA(这里设计成RNA荧光报告系统)，与等温扩增技术recombinasepolymeraseamplification(RPA)相结合，把这种检测方法称为SHERLOCK(SpecificHighSensitivityEnzymaticReporterUnLOCKing)。上述方法涉及到RNA的检测，如果只需针对DNA的检测，鉴于RNA的不稳定性，可能会增加了操作难度。2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶标核酸分子的检测方法。本专利技术的另一目的是提供一种Cas蛋白在靶标核酸分子的检测方法中的用途。本专利技术还公开了一种试剂盒，包括向导RNA、Cas蛋白、核酸探针、缓冲液。一种靶标核酸分子的检测方法，将含有待检靶标核酸分子的反应体系中，向导RNA、Cas蛋白、核酸探针、缓冲液，然后对其进行荧光检测。所述Cas蛋白为Cas12a。所述的Cas12a优选为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种。所述的Cas12a优选为LbCas12a。向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA的RNA。待检靶标核酸分子的反应体系中的待检靶标核酸分子经过扩增后得到。该检测方法可检测病原微生物、基因突变或特异靶标DNA。一种Cas蛋白在靶标核酸分子的检测方法中的用途。靶标DNA、向导RNA和Cas蛋白形成三元复合体时，该复合物会切割体系中其它的单链DNA分子。向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA的RNA。一种试剂盒，包括向导RNA、Cas蛋白、核酸探针。还包括缓冲液。本专利技术的主要优点在于：(1)快速：在测试条件准备好的情况下，从拿到样品，到拿到检测结果只需约1小时。(2)低成本：实验中没有特殊的材料或酶，而且涉及到的材料、试剂等较少，可以进行微量化的测试分析。(3)高效：本专利技术具有极高的灵敏度，可以检测到10aM浓度的DNA。(4)多通道：可制成多通道检测形式，比如在96孔板或384孔板反应并检测。(5)简单：没有特殊复杂的步骤，如果制成试剂盒以及设定好程序，只需简单的加入样品等操作。附图说明图1显示了Cas12a切割单链DNA的cis特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：/n(a)Cas蛋白，所述Cas蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；/n(b)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和/n(c)核酸探针，所述核酸探针为单链DNA；/n其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：
(a)Cas蛋白，所述Cas蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；
(b)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和
(c)核酸探针，所述核酸探针为单链DNA；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。


2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白是Cas12b(即C2c1)。


3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的Cas12a为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种。


4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的Cas12a为LbCas12a或FnC...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：上海吐露港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31