高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产O-乙酰高丝氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术利用易错PCR随机突变和基于结构信息的定点饱和突变方法获得了多种酶活性和/或抗反馈抑制能力提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，相对于野生型的高丝氨酸乙酰转移酶存在G118V、F147I、M182T和M240G中一个或多个突变。在一具体实施中，突变体的酶活性比野生型提高了15.2倍，并具有较强的反馈抑制抗性，当10 mM

【技术实现步骤摘要】
高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产O-乙酰高丝氨酸中的应用
本专利技术涉及一种酶活性和抗反馈抑制提升的高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在制备O-乙酰高丝氨酸中应用，属于生物工程领域。
技术介绍
L-甲硫氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于饲料，食品，医药以及化妆品等领域，具有广阔的应用前景（HuangJF,etal.MetabolicengineeringofEscherichiacoliformicrobialproductionofL-methionine.BiotechnolBioeng,2017,114:843-51）。目前，甲硫氨酸主要通过化学合成的方法进行生产。然而由于其能耗高，工艺路线复杂，生产成本高，环境污染大，从而极大地限制了大规模甲硫氨酸的工业化生产。同时化学合成法的产物为DL-甲硫氨酸的混合物，分离难度大，仅能应用于饲料添加。随着能源和环境危机的日益严峻，利用成本低廉、环境友好、产物单一的微生物发酵法合成L-甲硫氨酸的研究越来越受到关注。然而由于细胞中L-甲硫氨酸合成途径复杂且受到严谨的调控作用，目前L-甲硫氨酸细胞工厂的产量和得率都比较低，尚无法满足工业化生产的需求。O-乙酰高丝氨酸（OAH）是L-甲硫氨酸合成的重要前体，能够在乙酰高丝氨酸巯解酶（EC2.5.1.49）的作用下直接与甲硫醇反应生成L-甲硫氨酸（WillkeT.Methionineproduction-acriticalreview.ApplMicrobiolBiot,2014,98:9893-914）。基于上述工艺路线，一种偶联发酵-酶转化的工艺路线被开发并用于L-甲硫氨酸的生产。该工艺首先通过微生物发酵合成OAH，然后再通过酶催化缩合甲硫醇生成L-甲硫氨酸，可以获得较高的产率。在该工艺中，通过发酵法合成OAH是制约L-甲硫氨酸合成的关键问题之一。高得率的OAH发酵生产能够有效降低生产成本，提高L-甲硫氨酸的生产效率。在微生物细胞中，O-乙酰高丝氨酸是由高丝氨酸和乙酰辅酶A在高丝氨酸乙酰转移酶（HomoserineO-acetyltransferase，HAT，EC:2.3.1.31）的催化作用下形成的。然而研究表明，高丝氨酸乙酰转移酶不仅具有较低的催化活性，还受到产物OAH的强烈反馈抑制，从而限制了OAH的高效生产（BourhyP,etal.HomoserineO-acetyltransferase,involvedintheLeptospirameyerimethioninebiosyntheticpathway,isnotfeedbackinhibited.JBacteriol,1997,179:4396-98）。因此，构建酶活性和抗反馈抑制能力提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，对OAH的高效生产具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体，以使得其酶活性和抗反馈抑制能力得到提高。本专利技术提供一种来源于Leptospirameyeri的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，相对于SEQIDNo.2所示氨基酸序列而言，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个或多个位点突变。优选实施方式之一是，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个位点突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸以及第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的组合突变；或者仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变。其中最优选地，仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸以及第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的组合突变。本专利技术进一步提供所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因。优先地实施方式中，所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因的核苷酸序列是在SEQIDNo.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。在更具体地实施方式中，所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因核苷酸序列优选为SEQIDNo.3（编码G118V-F147I-M182T）、SEQIDNo.4（编码G118V-F147I-M240G）、SEQIDNo.5（编码F147I-M182T-M240G）以及SEQIDNo.6（编码G118V-F147I-M182T-M240G）所示。本专利技术还提供含有如所述这高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因的表达载体和宿主细胞。本专利技术还提供所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体或其编码基因在制备O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸中的应用。在具体实施方式中，其是通过构建微生物细胞工厂用于发酵生产O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸。在更具体的实施方式中，所述微生物细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。本专利技术是通过下述的技术思路实现的：将来源于Leptospirameyeri的高丝氨酸乙酰转移酶（HAT）基因构建到表达载体上，获得带有目的酶编码基因的重组质粒。将上述重组质粒转入大肠杆菌感受态中，进行目的酶诱导表达，并对酶活性和抗反馈抑制能力进行测定。本专利技术采用易错PCR随机突变方法所述的高丝氨酸乙酰转移酶基因进行定向进化。通过对目的基因片段进行PCR扩增，获得目的基因突变序列文库，并将其构建到表达载体上，获得高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库。本专利技术采用高通量筛选的方法对所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库进行高通量筛选，获得了三个酶活性提高的突变体，其突变位点分别为G118V、F147I和M182T(即原始基因序列的第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸)。本专利技术还对所述的高丝氨酸乙酰转移酶进行同源建模，并对底物通道3Å范围内的氨基酸残基（L236，M240，Y267，E270，P348，A349，L356和P357）进行饱和定点突变，经过高通量筛选获得了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于

【技术特征摘要】
1.一种来源于Leptospirameyeri的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，相对于SEQIDNo.2所示氨基酸序列而言，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个突变或多个组合突变。


2.如权利要求1所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个位点突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，魏亮，徐宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12