一种HEK293细胞组合梯度培养基及其用途制造技术

一种用于HEK293细胞的浓度梯度培养基组，包括培养时按时间顺序添加的基础培养基，补料培养基X，补料培养基Y，补料培养基Z；其中维生素，血清替代物中不同成分的浓度从基础培养基到补料培养基Z呈不同变化趋势，从而达到提高外源蛋白浓度、提高细胞稳定性、提高包装病毒滴度的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种HEK293细胞组合梯度培养基及其用途
本专利技术涉及生物
，具体属于HEK293细胞培养基领域。
技术介绍
越来越多的基因和免疫疗法获批进入临床试验，无血清培养基成为抗体及重组蛋白生产的主要细胞培养基。培养基一般而言使用一次性加入的方式进行细胞培养，但有些工程类细胞种类除了承担基础代谢，还需要承担人工引入外源物质代谢，与特定信号通路的激活有关，需要多种物质供应，然而一次性加入所有的物质以及直接达到最高浓度，可能会导致培养基渗透压过高，培养基过于黏稠，溶氧降低，影响细胞生长效率以及代谢物质活性。分批补料可一定程度上解决上述问题。现有技术中已有类似研究，EP592692B1即公开了一种293菌株培养方法，在初始细胞培养时维持一定钙离子浓度，使细胞增殖到细胞密度为3倍左右时，向培养液中加入糖和钙，基本上抑制细胞密度的增加以维持蛋白质的产生，继续增加直到蛋白质浓度不再显著增加后停止培养。然而上述方法中细胞倾向于通过添加钙盐而聚集成团块，虽然细胞密度增加被抑制，然而实际培养中，有用蛋白的分泌依然一定程度上被抑制，并且影响溶氧，使得细胞生长状态下降；CN106754817A公开了293细胞的分批培养表达重组ATX的方法，利用FreeStyle293表达培养基扩大培养，在24h、48h、60h进行不同体积的补料，这种方式补料培养基都采用相同的成份，对于细胞不同的生长阶段没有针对性，对于外源蛋白的表达仍然没有明显的提高；CN102604889A法采用了适应无血清培养的HEK293细胞系，使用了渐进式浓度以及血清含量的培养基，但其仍然采用基本相同的成分，没有对具体营养成分进行梯度优化；崔玉等发现，在293细胞培养过程中，不同类型的氨基酸代谢随着时间有一定变化，葡萄糖对293培养也有一定重要作用且不能被其他成份代替，调整培养基成份和细胞数量可以提高细胞的生长速率，但该文章仅考察了氨基酸变量并且只进行了粗分类，也并没有给出明确的培养基成份。LeticiaListe-Calleja等发现使用分批培养基添加培养293细胞，可以提高细胞密度，但其仍然局限于血清浓度的优化以及逐步添加，并且细胞密度最高达到106数量级。根据现有技术可知，HEK293细胞是抗体和重组蛋白表达的重要平台，但培养过程中，常常由于细胞株差异、环境差异等造成生长速度、密度、状态降低，限制了表达药物的质量和产量。分批添加培养基可改善这一状态，但现有技术中采用分批培养的技术仍然存在一定问题。因此优化分批次的293细胞培养基是亟待解决的问题。
技术实现思路
根据现有技术存在的问题，专利技术人欲针对293细胞培养基进行分批次培养基的优化，以期提高代谢产物活性。由于血清可能带来不明污染，已经逐步被血清替代物取代，一般包括转铁蛋白、类脂混合物、胰岛素或IGF-1、生长因子、激素等；在细胞生长代谢中，维生素不作为能源，而是作为细胞的组成成分。维生素作为维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用，许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分。专利技术人经过研究发现，HEK293细胞培养基的常见成份中，糖类、无机盐、氨基酸基础性营养物质，分批次加入对于细胞培养状态影响较小，微量元素含量极低，因此上述物质一次性加入可维持细胞正常培养状态。而血清替代物的部分物质以及维生素，因参与细胞表达，在细胞代谢中起到调控和调节作用，其浓度、种类与细胞生长曲线、生长周期有密切的联系，由于细胞培养启动时有一个适应过程，此时对于部分成份直接将全浓度的营养成分加入，会抑制细胞代谢，影响产物活性，而对于部分成份先以低浓度加入又会影响细胞状态，因此在同一类物质中细胞的生长代谢过程中仍然因具体种类不同而产生代谢速度、吸收选择、浓度抑制、以及参与信号通路的不同，专利技术人以此为契机进行分批次培养基设计。通过观察HEK293细胞对于营养物质代谢速度、细胞生长状态以及代谢物质活性，将营养物质进行浓度分类，其中氨基酸、无机盐、糖、微量元素可一次性加入无需分批，而维生素类和部分血清替代品需进行不同浓度分批，基础培养基，补料培养基X，补料培养基Y，补料培养基Z四组培养基中的浓度，分为无、低浓度、维持浓度、中浓度、高浓度五个级别。其中基础培养基为启动培养基，补料培养基X-补料培养基Z总体而言属于维持性培养基，而补料培养基Z加入后可提高细胞代谢活性。A类（高—中—维—维）：维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，维生素E，烟酰胺，胰岛素，转铁蛋白；B类（低—维—中—高）：核黄素，维生素K2，维生素K3，生物素，D-泛酸钙，胆固醇，牛血清白蛋白，类脂混合物；C类（无—低—维—中）：叶酸，肌醇，吡哆醇盐酸盐，硫辛酸，氯化胆碱；聚乙二醇，Primatone。其中维持浓度，为通过记录细胞密度、观察细胞状态、测量代谢物质活性等方面综合考量，计算得出的细胞状态仅限于维持状态的浓度，高浓度为激发细胞活力的最高浓度。本专利技术公开了一种培养基组，所述趋势分为三类，A类为高浓度-中浓度-维持浓度-维持浓度，涉及的营养成分包括维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，维生素E，烟酰胺，胰岛素，转铁蛋白；B类为低浓度-维持浓度-中浓度-高浓度，涉及的营养成分包括核黄素，维生素K2，维生素K3，生物素，D-泛酸钙，胆固醇，牛血清白蛋白，类脂混合物；C类为无-低浓度-维持浓度-中浓度，涉及的营养成分包括叶酸，肌醇，吡哆醇盐酸盐，硫辛酸，氯化胆碱，聚乙二醇，Primatone。其中，所述外源蛋白为VEGF蛋白、或寨卡病毒的M蛋白；所述病毒为表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒。本专利技术还公开了一种HEK293细胞培养方法，使用本专利技术所公开的基础培养基复苏HEK293细胞，12h后更换为补料培养基X，继续培养36h后传代使用补料培养基Y，继续培养36h后传代使用补料培养基Z，其中，每次传代细胞接种密度为1-2×106/ml。具体步骤为：步骤1：将冻存的HEK293细胞在基础培养基中复苏，复苏条件为37℃，5%CO2，使用权利要求1-5任一项所述的培养基组中基础培养基进行复苏，保持细胞状态；步骤2：对细胞进行计数，观察细胞活率，当复苏活率可达70%以上时，和/或培养时间达到12h，更换为补料培养基X，用于使细胞适应培养环境，继续培养计算细胞活率，当大于95%且判断细胞处于对数期时，和/或继续培养时间36h后，开始使用本专利技术优化的补料培养基Y，继续培养36h传代培养，使用补料培养基Z，保证细胞一直位于对数生长期，接种密度为1-2×106/ml；步骤3：当细胞密度达到约3-4×106时，将细胞以3×106/ml的密度接种到六孔板中培养过夜；步骤4：准备转染质粒1-2mg/ml，转染试剂PEI2-4mg/ml，用本专利技术优化的补料培养基Z稀释转染质粒，使用涡旋振荡仪混匀后，加入六孔板中，并补入补料培养基Z进行培养；步骤5：37℃，5%CO2条件进行孵育72h后，采用0.25%胰酶消化，1500rpm/min离心收集细胞；步骤6：收获细胞和表达产物，检测细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养基组，包括按时间顺序添加的基础培养基、补料培养基X、补料培养基Y、补料培养基Z，所述培养基组的成分包括基础成分氨基酸、无机盐、微量元素、糖、维生素、血清替代物，其特征在于，所述维生素和血清替代物中各组分浓度，从基础培养基到补料培养基Z，其浓度变化呈现不同的趋势。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养基组，包括按时间顺序添加的基础培养基、补料培养基X、补料培养基Y、补料培养基Z，所述培养基组的成分包括基础成分氨基酸、无机盐、微量元素、糖、维生素、血清替代物，其特征在于，所述维生素和血清替代物中各组分浓度，从基础培养基到补料培养基Z，其浓度变化呈现不同的趋势。


2.根据权利要求1所述的培养基组，其特征在于，所述浓度趋势分为无、低浓度、维持浓度、中浓度、高浓度五个级别，使得维生素和血清替代物的不同组分在从基础培养基到补料培养基Z中呈现浓度升高和/或浓度降低的趋势。


3.根据权利要求2所述的培养基组，其特征在于，所述趋势分为三类，A类为高浓度-中浓度-维持浓度-维持浓度，涉及的营养成分包括维生素B1，维生素B2，维生素B12，维生素C，维生素E，烟酰胺，胰岛素，转铁蛋白；B类为低浓度-维持浓度-中浓度-高浓度，涉及的营养成分包括核黄素，维生素K2，维生素K3，生物素，D-泛酸钙，胆固醇，牛血清白蛋白，类脂混合物；C类为无-低浓度-维持浓度-中浓度，涉及的营养成分包括叶酸，肌醇，吡哆醇盐酸盐，硫辛酸，氯化胆碱，聚乙二醇，Primatone。


4.根据权利要求3所述的培养基组，其特征在于，以mg/L为单位，所述培养基组中的维生素和血清替代物配方为：











维生素
基础培养基
补料培养基X
补料培养基Y
补料培养基Z


维生素B1
9.8-10.2
5.5-9.8
4.5-5.5
4.5-5.5


维生素B2
0.8-1.2
0.52-0.8
0.48-0.52
0.48-0.52


维生素B12
1.8-2.2
1.2-1.8
0.8-1.2
0.8-1.2


维生素C
9.8-10.2
5.2-9.8
4.8-5.2
4.8-5.2


维生素E
1.8-2.2
1.2-1.8
0.8-1.2
0.8-1.2


烟酰胺
0.65-0.75
0.37-0.65
0.33-0.37
0.33-0.37


核黄素
0.1-0.2
0.2-0.3
0.3-0.48
0.48-0.52


维生素K2
0.1-0.3
0.3-0.6
0.6-0.8
0.8-1.2


维生素K3
0.1-0.3
0.3-0.6
0.6-0.8
0.8-1.2


生物素
0.001-0.003
0.003-0.006
0.006-0.008
0.008-0.012


D-泛酸钙
2-3
3-6
6-9
9-11


叶酸
0
0.003-0.006
0.008-0.015
0.018-0.022


肌醇
0
0.015-0.02
0.02-0.03
0.048-0.052


吡哆醇盐酸盐
0
0.012-0.02
0.02-0.03
0.048-0.052


硫辛酸
0
0.12-0.2
0.2-0.4
0.48-0.52


氯化胆碱
0
0.014-0.02
0.02-0.05
0.055-0.065


血清替代物
基础培养基
补料培养基X
补料培养基Y
补料培养基Z


胰岛素
18-22
12-18
9-11
9-11


转铁蛋白
18-22
12-18
9-11
9-11


胆固醇
47-53
90-110
110-190
190-210


牛血清白蛋白
34-36
45-55
55-95
95-105


类脂混合物
0
0.1-0.2%v/v
0.2-0.4%v/v
0.4-0.6%v/v


Primatone
0
1700-1900
1900-4800
4800-5200


聚乙二醇
0
0.03-0.04
0.04-0.07
0.07-0.09






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【专利技术属性】
技术研发人员：肖志华，
申请(专利权)人：上海奥浦迈生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31