一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基，所述分子培养基由WNR‑J2条件培养基和基础培养基组成；所述WNR‑J2条件培养基在分子培养基中的体积百分比浓度为50~60%，所述基础培养基由Advanced DMEM/F12、HEPES缓冲液、B27血清替代物、胃泌素I、N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸、尼克酰胺10M、L‑谷氨酰胺、N2‑MAX、乙醇胺和EGF表皮生长因子组成。该分子培养基适用哺乳仔猪、断奶仔猪和肥育猪小肠隐窝分离及培养，猪小肠类器官长期传代及维持和猪肠道营养与疾病建模。

【技术实现步骤摘要】
一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基。
技术介绍
肠道上皮细胞发育及其营养调控一直以来是动物营养研究的核心问题，以至于行业内有“养猪就是养肠道”的提法。传统的方法是基于猪小肠上皮细胞IPEC～J2，IPEC～J1和人结肠癌细胞CACO～2等建立体外模型来考察肠道营养转运、代谢和调控，而细胞模型存在本质上的缺陷，主要表现在三个方面：1.通常由单一或者多个细胞系组成，并不能真实的复现肠道绒毛的各种细胞类群，如杯状细胞，潘氏细胞和内分泌细胞等。2.不能复现肠道组织结构的特异性，无法模拟组织水平上的营养转运单向性和复杂营养素转运。3.无法复现肠道隐窝～绒毛轴营养池(nutrientpools)及隐窝干细胞微环境。这些局限性是无法避免与根本性改善的，严重阻碍了动物分子营养研究，尤其是复杂营养物质转运与代谢机制研究的推进。随着肠道干细胞研究的深入和3D类器官技术在人体医学领域兴起，国内外很多团队开始尝试使用猪隐窝干细胞来源的肠道类器官用于营养吸收调控以及疾病建模。肠道类器官能够最大程度上还原肠道组织细胞组成异质性、隐窝～绒毛结构单元和基因表达特征。国外UCLA洛杉矶分校团队发布了一种基于成体猪肠道干细胞的类器官培养方法，培养基主要是基于小鼠ENR培养基，添加重组生长因子蛋白和抑制剂(KhalilHA,LeiNY,BrinkleyG,etal.Anovelculturesystemforadultporcineintestinalcrypts[J].Cellandtissueresearch,2016,365(1):123～134.)。此后，也有多个研究团队使用小鼠类器官培养基用来培养猪肠道类器官，如国内南京农大团队使用STEMCELL公司小鼠类器官培养基，建立猪小肠类器官模型，用于研究猪腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)与肠道免疫的互作(LiL,FuF,GuoS,etal.Porcineintestinalenteroids:anewmodelforstudyingentericcoronavirusporcineepidemicdiarrheavirusinfectionandthehostinnateresponse[J].Journalofvirology,2019,93(5).)。华南农大团队基于小鼠ENR培养基引入CDX2等促增殖因子，建立了猪肠道类器官模型，用于猪肠道干细胞损伤修复研究(LiXG,ZhuM,ChenMX,etal.AcuteexposuretodeoxynivalenolinhibitsporcineenteroidactivityviasuppressionoftheWnt/β～cateninpathway[J].Toxicologyletters,2019,305:19～31.)。上述方法的肠道类器官培养与建模，其培养基主要依托小鼠或人类器官营养组分和细胞因子。。但目前小鼠培养基用来培养猪肠道类器官仍存在一些问题：1.培养仔猪小肠隐窝干细胞分离来源的类器官形成率低，且容易凋亡。2.类器官细胞组成和基因表达与猪小肠基因表达存在一定差异。3.无法高代次(20代以上)反复冻存复苏，容易出现膨胀现象，无法分化。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，为提供稳定的猪小肠类器官模型供营养研究，提供了一种基于猪小肠生理生化特性的用于猪小肠类器官培养的分子培养基。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述用于猪小肠类器官培养的分子培养基由WNR-J2条件培养基和基础培养基组成；所述WNR-J2条件培养基在分子培养基中的体积百分比浓度为50～60％，其余为基础培养基；所述WNR-J2条件培养基按如下步骤制备而成：(1)制备JM培养基(WNR-J2培养用培养基)：将猪血清、DMEM高糖培养基和青霉素/链霉素双抗按体积比1:(3～4)：(0.005～0.015)混匀，于4℃保存备用；(2)将10mLJM培养基于37℃水浴预热后转移至T25培养瓶；(3)将冻存的WNR-J2细胞于37℃水浴进行解冻，得WNR-J2细胞溶液；(4)将WNR-J2细胞溶液转移至步骤(2)准备的装有JM培养基的T25培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱连续培养2～3d，至细胞完全长满T25培养瓶贴壁融合为止；(5)移除T25培养瓶中的JM培养基；(6)向移除JM培养基后的T25培养瓶中加入1mL温和型无酶解离液，使温和型无酶解离液均匀覆盖T25培养瓶内壁的细胞层表面，于37℃培养箱解离5～8min；(7)在7℃下预热25mL新的JM培养基，并用6mL预热后的JM培养基重选T25培养瓶中的细胞，得细胞悬液，然后将细胞悬液转移至T150培养瓶，再将预热的剩余的19mLJM培养基加入T150培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱培养24h；(8)经步骤(7)培养后，移除JM培养基，然后加入25mLSM筛选培养基培养24h，剔除非WNR-J2细胞；(9)经步骤(8)培养后，更换SM筛选培养基为25mL新的JM培养基，继续培养WNR-J2细胞，至WNR-J2细胞完全长满T150培养瓶贴壁融合为止；(10)经步骤(9)培养后，移除旧的JM培养基，加入120mL新的JM培养基，将所得的WNR-J2细胞悬浮液按25mL每份分装至多个T150培养瓶，再分别于37℃，5％CO2培养箱连续培养2～3d，至WNR-J2细胞完全融合且有WNR-J2细胞聚集脱落为止；(11)经步骤(10)培养后，移除旧的JM培养基，再加入25mL新的JM培养基，于37℃，5％CO2培养箱继续培养24h，即得条件培养基；(12)每24h收集一次每个T150培养瓶中的条件培养基到50mL离心管，然后向T150培养瓶中加入25mL新的JM培养基后，于37℃，5％CO2培养箱继续培养；(13)将收集有条件培养基的离心管于室温、2000g条件下离心5～10min，吸取上清液至储存瓶，于4℃保存；(14)将JM培养基与上清液按体积比1:1混合，配制成体积百分比终浓度为50％的WNR-J2条件培养基，可于-20℃保存一个月，-80℃保存三个月；所述基础培养基由AdvancedDMEM/F12培养基、HEPES缓冲液、B27血清替代物、胃泌素I、N-乙酰基-L-半胱氨酸、尼克酰胺、L-谷氨酰胺、N2-MAX、乙醇胺和EGF表皮生长因子组成；AdvancedDMEM/F12培养基在分子培养基中的体积百分比为40～50％，所述B27血清替代物、胃泌素I、N-乙酰基-L-半胱氨酸、尼克酰胺、L-谷氨酰胺、N2-MAX、乙醇胺和EGF表皮生长因子在分子培养基的浓度或体积百分比含量分别为：HEPES缓冲液10～15mM、B27血清替代物1～1.5％，胃泌素I10～15nM，N-乙酰基-L-半胱氨酸1～1.5mM，尼克酰胺10～15M，L-谷氨酰胺1.5～2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基，其特征在于，所述分子培养基由WNR-J2条件培养基和基础培养基组成；所述WNR-J2条件培养基在分子培养基中的体积百分比浓度为50～60％，其余为基础培养基；/n所述WNR-J2条件培养基按如下步骤制备而成：/n(1)制备JM培养基：将猪血清、DMEM高糖培养基和青霉素/链霉素双抗按体积比1:(3～4)：(0.005～0.015)混匀，于4℃保存备用；/n(2)将10mL JM培养基于37℃水浴预热后转移至T25培养瓶；/n(3)将冻存的WNR-J2细胞于37℃水浴进行解冻，得WNR-J2细胞溶液；/n(4)将WNR-J2细胞溶液转移至步骤(2)准备的装有JM培养基的T25培养瓶，于37℃、5％CO

【技术特征摘要】
1.一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基，其特征在于，所述分子培养基由WNR-J2条件培养基和基础培养基组成；所述WNR-J2条件培养基在分子培养基中的体积百分比浓度为50～60％，其余为基础培养基；
所述WNR-J2条件培养基按如下步骤制备而成：
(1)制备JM培养基：将猪血清、DMEM高糖培养基和青霉素/链霉素双抗按体积比1:(3～4)：(0.005～0.015)混匀，于4℃保存备用；
(2)将10mLJM培养基于37℃水浴预热后转移至T25培养瓶；
(3)将冻存的WNR-J2细胞于37℃水浴进行解冻，得WNR-J2细胞溶液；
(4)将WNR-J2细胞溶液转移至步骤(2)准备的装有JM培养基的T25培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱连续培养2～3d，至细胞完全长满T25培养瓶贴壁融合为止；
(5)移除T25培养瓶中的JM培养基；
(6)向移除JM培养基后的T25培养瓶中加入1mL温和型无酶解离液，使温和型无酶解离液均匀覆盖T25培养瓶内壁的细胞层表面，于37℃培养箱解离5～8min；
(7)在7℃下预热25mL新的JM培养基，并用6mL预热后的JM培养基重选T25培养瓶中的细胞，得细胞悬液，然后将细胞悬液转移至T150培养瓶，再将预热的剩余的19mLJM培养基加入T150培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱培养24h；
(8)经步骤(7)培养后，移除JM培养基，然后加入25mLSM筛选培养基培养24h，剔除非WNR-J2细胞；
(9)经步骤(8)培养后，更换SM筛选培养基为25mL新的JM培养基，继续培养WNR-J2细胞，至WNR-J2细胞完全长满T150培养瓶贴壁融合为止；
(10)经步骤(9)培养后，移除旧的JM培养基，加入120mL新的JM培养基，将所得的WNR-J2细胞悬浮液按25mL每份分装至多个T150培养瓶，再分别于37℃，5％CO2培养箱连续培养2～3d，至WNR-J2细胞完全融合且有WNR-J2细胞聚集脱落为止；
(11)经步骤(10)培养后，移除旧的JM培养基，再加入25mL新的JM培养基，于37℃，5％CO2培养箱继续培养24h，即得条件培养基；
(12)每24h收集一次每个T150培养瓶中的条件培养基到50mL离心管，然后向T150培养瓶中加入25mL新的JM培养基后，于37℃，5％CO2培养箱继续培养；
(13)将收集有条件培养基的离心管于室温、2000g条件下离心5～10min，吸取上清液至储存瓶，于4℃保存；
(14)将JM培养基与上清液按体积比1:1混合，配制成体积百分比终浓度为50％的WNR-J2条件培养基；
所述基础培养基由AdvancedDMEM/F12培养基、HEPES缓冲液、B27血清替代物、胃泌素I、N-乙酰基-L-半胱氨酸、尼克酰胺、L-谷氨酰胺、N2-MAX、乙醇胺和EG...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊霞，周健，邵宜锐，吴宇梁，印遇龙，
申请(专利权)人：中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43