一种抵抗DNA损伤的材料及其制备方法技术

本发明专利技术公开了本实施例公开了一种抵抗DNA损伤的材料，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术对DNA损伤物质，如甲基磺酸甲酯(MMS)的胁迫处理具有较强的抗性，可以在调控植物化学性DNA损伤中发挥重要作用，还可以应用于培育植物新品种。

【技术实现步骤摘要】
一种抵抗DNA损伤的材料及其制备方法
本专利技术涉及转基因植物领域，具体涉及一种抵抗DNA损伤的材料及其制备方法。
技术介绍
植物在发育过程中会经常受到化学胁迫的影响，导致植物的基因发生突变。因此，需要一种可以抵抗DNA损伤的材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述问题，提供一种抵抗DNA损伤的材料及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抵抗DNA损伤的材料，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还公开了一种抵抗DNA损伤的材料的制备方法，包括如下步骤：S1.EMS诱变：1mL的35S-SUC2的种子经过EMS诱变后，播种于土中；分成若干组，每组混合收种；M1的种子播种于含2％蔗糖的1/2MS中，挑长根的苗子种在土里；每一个组里的长根苗收到的种子即为一个突变体，M2,并以序列号命名；M2通过与野生型即35S-SUC2回交2次，以排除无义突变；S2.F2杂交材料的准备：经过2次回交后的纯合子与拟南芥的另一种生态型Landsbergerecta杂交，F1代为短根，F1种子种植下去，收种后即为F2的杂合子，用于后续的图位克隆；S3.图位克隆:S3-1:将1/2MS固体培养基分装至1L的玻璃瓶中，每瓶800mL,放入搅拌子，加1％的琼脂粉，121℃高温灭菌20min；灭菌后让培养基冷却至50℃左右，按照1/2500的体积比加入潮霉素；S3-2:倒板，为15x15cm培养皿；S3-3:播种，每个培养皿播150-200F2种子，每个突变体种10个培养皿；在超净工作台内吹干，用封口膜封好放入4℃春化两天后，放入到组培室生长；S3-4:挑选长短根苗:在组培室生长七天后，F2的苗子会出现长短根分离症状，统计长短根分离比，确定其为隐性基因；去掉短根的苗子和根尖在空气中的苗子，保留长根的苗子，并在长根苗子的根尖地方做标记，让其再生长两天；S3-5：取样和提取DNA:采样那些能进一步生长的长根苗，分别放置于1.5ml的试管里，每个突变体取96个样本；使用SDS方法提取DNA；S3-6：初步定位:从每个突变体的96个样品里，分别取10ulDNA混匀，做PCR；用5条染色体的上的25个标记引物来进行初定位；每次做PCR时，以Col0,Col-0与Ler杂交的F1代DNA为对照；找到相应的连锁标记，单个样品进行PCR扩增确定，4％琼脂糖胶分离，200v35分钟；S3-7:确认粗定位结果:操作方法与S3-6相同，然后使用4％电泳胶分离，经过这一步后可以将定位区间缩小至5M；S3-8：细定位：根据S3-7的定位区间，设计引物细定位，将Mapping区间缩小到1M内；S3-9：全基因组测序：根据全基因组测序结果，在细定位区间里找到突变的候选基因；S4.根长互补实验：扩增相应基因的DNA序列及2Kb的自身启动子，连接到pEnter入门载体，然后通过LR穿梭反应，连接到相应的表达载体；最后，将带有目的基因的表达载体转入到GV3101上进行转基因，根据抗性进行筛选；通过Western进行蛋白表达量的鉴定，至T2代，转基因纯合以后，通过qPCR检测相关标记基因的表达，检测根的长短来确定所需要的图位克隆基因，根据根长否分离及抗性来确定是否为转基因纯合子。作为改进，S3-1中所述1/2MS固体培养基的总体积为4L，其中含有：MSbasalsalt8.66g；MES2g；蔗糖80g，并且调pH到5.7-5.8。作为改进，S3-1中所述加入潮霉素后，潮霉素的最终浓度为20mg/L。作为改进，S3-3中所述在组培室生长采用向上生长的方式，并将板子稍微倾斜，有利于根着陆。作为改进，S3-5中每个所述试管中的SDS提取液包括：50mmolTris-HCl，100mmolNaCl，10mmolEDTA，和占提取液重量1％的SDS。本专利技术的优点在于：本专利技术对DNA损伤物质，如甲基磺酸甲酯(MMS)的胁迫处理具有较强的抗性，可以在调控植物化学性DNA损伤中发挥重要作用，还可以应用于培育植物新品种。附图说明图1为实施例1中一种抵抗DNA损伤的材料的基因测序图谱；图2为实施例1中一种抵抗DNA损伤的材料初步定位步骤的筛选；所筛选的材料为实施例1公开的ARP4-2材料,拟南芥野生型(WT)和Col-0对照组；图3为实施例1中一种抵抗DNA损伤的材料arp4-2生长发育表型；图4为实施例1中通过转基因回补实验验证突变体材料；图5为实施例1中arp4-2材料对DNA损伤物质，甲基磺酸甲酯(MMS)胁迫处理中的应用的示意图。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限定本专利技术的保护范围。实施例1本实施例公开了一种抵抗DNA损伤的材料，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本实施例的制备方法，包括如下步骤：S1.EMS诱变：1mL的35S-SUC2的种子经过EMS诱变后，播种于土中；分成若干组，每组混合收种；M1的种子播种于含2％蔗糖的1/2MS中，挑长根的苗子种在土里；每一个组里的长根苗收到的种子即为一个突变体，M2,并以序列号命名；M2通过与野生型即35S-SUC2回交2次，以排除无义突变。S2.F2杂交材料的准备：经过2次回交后的纯合子与拟南芥的另一种生态型Landsbergerecta杂交，F1代为短根，F1种子种植下去，收种后即为F2的杂合子，用于后续的图位克隆。S3.图位克隆:S3-1:将1/2MS固体培养基分装至1L的玻璃瓶中，每瓶800mL,放入搅拌子，加1％的琼脂粉，121℃高温灭菌20min；灭菌后让培养基冷却至50℃左右，按照1/2500的体积比加入潮霉素，使潮霉素的最终浓度为20mg/L。1/2MS固体培养基的总体积为4L，其中含有：MSbasalsalt8.66g；MES2g；蔗糖80g，并且调pH到5.7-5.8。S3-2:倒板，为15x15cm培养皿；S3-3:播种，每个培养皿播150-200F2种子，每个突变体种10个培养皿；在超净工作台内吹干，用封口膜封好放入4℃春化两天后，放入到组培室生长，组培室生长采用向上生长的方式，并将板子稍微倾斜，有利于根着陆。S3-4:挑选长短根苗:在组培室生长七天后，F2的苗子会出现长短根分离症状，统计长短根分离比，确定其为隐性基因；去掉短根的苗子和根尖在空气中的苗子，保留长根的苗子，并在长根苗子的根尖地方做标记，让其再生长两天。S3-5：取样和提取DNA:采样那些能进一步生长的长根苗，分别放置于1.5ml的试管里，每个突变体取96个样本；使用SDS方法提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抵抗DNA损伤的材料，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抵抗DNA损伤的材料，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.一种根据权利要求1所述抵抗DNA损伤的材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.EMS诱变：
1mL的35S-SUC2的种子经过EMS诱变后，播种于土中；分成若干组，每组混合收种；M1的种子播种于含2％蔗糖的1/2MS中，挑长根的苗子种在土里；每一个组里的长根苗收到的种子即为一个突变体，M2,并以序列号命名；M2通过与野生型即35S-SUC2回交2次，以排除无义突变；
S2.F2杂交材料的准备：
经过2次回交后的纯合子与拟南芥的另一种生态型Landsbergerecta杂交，F1代为短根，F1种子种植下去，收种后即为F2的杂合子，用于后续的图位克隆；
S3.图位克隆:
S3-1:
将1/2MS固体培养基分装至1L的玻璃瓶中，每瓶800mL,放入搅拌子，加1％的琼脂粉，121℃高温灭菌20min；灭菌后让培养基冷却至50℃左右，按照1/2500的体积比加入潮霉素；
S3-2:
倒板，为15x15cm培养皿；
S3-3:
播种，每个培养皿播150-200F2种子，每个突变体种10个培养皿；在超净工作台内吹干，用封口膜封好放入4℃春化两天后，放入到组培室生长；
S3-4:
挑选长短根苗:在组培室生长七天后，F2的苗子会出现长短根分离症状，统计长短根分离比，确定其为隐性基因；去掉短根的苗子和根尖在空气中的苗子，保留长根的苗子，并在长根苗子的根尖地方做标记，让其再生长两天；
S3-5：
取样和提取DNA:采样那些能进一步生长的长根苗，分别放置于1.5ml的试管里，每个突变体取96个样本；使用SDS方法提取DNA；
S3-6：
初步定位:从每个突变体的96个样品里，分别取10ulDNA混匀，做PCR；用5条染色体的上的25个标记引物来进行初定位；每次做PCR时，以Col0,...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂文锋，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32