人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型及其制备方法和用途技术

一种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型，其基因型为Cdk13

【技术实现步骤摘要】
人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型及其制备方法和用途
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种小鼠模型，尤其涉及一种基因敲除小鼠，具体来说是一种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型及其制备方法和用途。
技术介绍
细胞周期蛋白依赖性激酶13(CDK13)是一种从酵母到人类都高度保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶(Bartkwiaketal.,2010)，通过和CyclinK形成复合物从而催化RNA聚合酶II蛋白C端Ser2位点发生磷酸化(Blazeketal.,2011；Greifenbergetal.,2016)。CDK13也参与转录调控(Blazeketal.,2011；Panetal.,2015；Greifenbergetal.,2016)，RNA可变剪接(Berroetal.,2008；Liangetal.,2015)和轴突的延伸(Chenetal.,2014)。通过人外显子组测序发现CDK13蛋白保守的丝氨酸-苏氨酸催化结构域内一系列错义突变和先天性心脏病、智力障碍和发育缺陷等相关(Sifrimetal.,2016)。另一个包含4293例发育异常患者的大规模外显子组测序也发现CDK13的突变(Mcraeetal.,2017)。进一步的基因和表型特征也验证了这些突变，并且定义了这种综合征的各种新的临床特征，例如面部及指端异常，智力障碍和发育迟缓，被称之为CDK发育缺陷综合症(Bostwicketal.,2017；Hamiltonetal.,2018；Akkeretal.2018)。但目前尚不知晓CDK13突变是否直接导致这种发育缺陷综合症，也不清楚导致表型缺陷背后的机制。因此建立相应的小鼠模型来研究确立CDK13突变与患者中缺陷综合征的关系与机制，从而为该疾病的治疗提供潜在线索，就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型及其制备方法和用途，所述的这种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型及其制备方法和用途要解决现有技术中没有合适的动物模型来研究人CDK13发育缺陷综合症，同时要解决现有技术中用于治疗人CDK13发育缺陷综合症的药物效果不佳的技术问题。本专利技术提供了一种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型，为Cdk13+/-或者Cdk13-/-。本专利技术还提供了上述人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型的制备方法，包括如下步骤：1)一个构建Cdk13flox小鼠的步骤，将Cdk13第三、四外显子两侧分别带有LoxP位点的Cdk13tm1a(EUCOMM)HmguES细胞株扩增后注射进野生型小鼠囊胚，通过胚胎移植，获得F0代小鼠，F0代小鼠再与野生型小鼠交配，繁育获得F1代小鼠，其基因型为Cdk13F/+,所述的F1代小鼠在第三、四外显子两侧分别带有LoxP位点的Cdk13flox小鼠，即Cdk13flox小鼠；2)一个制备Cdk13+/-敲除小鼠的步骤；将步骤1)构建的在第三、四外显子两侧分别带有LoxP位点的Cdk13flox小鼠先与FLP工具小鼠交配，获得的小鼠的基因型为Cdk13fl/+；FLP,然后再与野生型小鼠交配获得不带neo和Flp的子代Cdk13flox小鼠，然后不带neo和Flp的子代Cdk13flox小鼠与生殖细胞中特异性表达的Ddx4-Cre工具小鼠进行杂交，敲除Cdk13基因第三和第四外显子，得到Ddx4-Cre；Cdk13fl/+小鼠，再将获得的Ddx4-Cre；Cdk13fl/+小鼠与野生型小鼠交配得到Cdk13+/-小鼠。进一步的，将Cdk13+/-雄鼠与Cdk13+/-雌鼠交配，获得Cdk13-/-小鼠。进一步的，步骤1)中，野生型小鼠为C57BL/6小鼠。本专利技术还提供了上述人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型在筛选用于治疗人CDK13发育缺陷综合症的药物中的用途。本专利技术还提供了组蛋白去乙酰化酶HDACs抑制剂在制备治疗人CDK13发育缺陷综合症的药物中的用途。本专利技术人经过研究，建立了一种遗传稳定、表型与人CDK13发育缺陷综合症吻合的小鼠模型，这种小鼠模型的Cdk13基因失活，可用于研究Cdk13基因的生物学功能方面，也可用于筛选治疗人CDK13发育缺陷综合症的新药及其他治疗方法。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术通过利用这模型筛选治疗人CDK13发育缺陷综合症药物，筛选到可以明显改善Cdk13缺陷小鼠记忆的小分子SAHA。附图说明：图1a显示了Cdk13等位基因敲除构建和方法；图1b显示通过DNA凝胶电泳带谱鉴定对照、杂合子(Cdk13F/+)胚胎基因型；图1c显示通过DNA凝胶电泳带谱鉴定和FLP小鼠杂交后子代小鼠野生型、杂合子(Cdk13fl/+)胚胎基因型；图1d显示通过DNA凝胶电泳带谱鉴定和Ddx-Cre小鼠杂交后子代小鼠野生型、杂合子(Cdk13fl/+)胚胎基因型；图1e显示通过DNA凝胶电泳带谱鉴定野生型、杂合子(Cdk13+/-)、纯合子(Cdk13-/-)胚胎基因型；图1f显示了western-blot检测Cdk13蛋白表达水平，*标注非特异性条带。图2a显示了不同发育阶段对照与Cdk13突变胚胎的表型(比例尺：E9.5，0.5mm；E11.5,1mm；E13.5,2mm)；图2b显示了胚胎体积(对照组n＝47；Cdk13+/-,n＝88；Cdk13-/-,n＝9)；图2c显示了胚胎质量(对照组n＝36；Cdk13+/-,n＝74；Cdk13-/-,n＝6)；图2d显示了胎盘质量(对照组n＝34；Cdk13+/-,n＝67；Cdk13-/-,n＝6)数据在表型下方；数据均以中位数-四分位间距显示。ns，无显著差异，*p＜0.05,****p<0.0001。图3显示了E13.5Cdk13敲除胚胎表型缺陷；其中，a为E13.5Cdk13-/-胚胎面部异常(比例尺：1mm)；b为E13.5Cdk13-/-胚胎胸腔/背部积水(比例尺：2mm)；c为Cdk13-/-胚胎神经管异常；d为E13.5Cdk13-/-胚胎指端异常(比例尺：0.5mm)。图4a显示了E13.5天对照组，Cdk13+/-和Cdk13-/-胚胎心脏横截面HE染色，Cdk13-/-胚胎心脏有室缺，胚胎基因型如图片顶部所示。E13.5胚胎心脏左心室壁厚度比较位于底层(比例尺：底层，20μm，其他，100μm)；图4b显示了左心室壁厚度统计(ns，无显著差异；*,p<0.05)。图5显示了用水迷宫测试(MWM)来进行智力水平测试。在训练完后第3(图5a)、5天(图5b)分别记录小鼠在每个象限所花的时间，图中还各自显示了每一组代表性游泳轨迹并统计了训练过程找到平台的时间(Control,n＝11；Cdk13+/-,n＝12)。四个象限包括northwest,northeast,southwestandsoutheast。*p＜0.05。连续训练7天，对照组和Cdk13+/-小鼠找到隐藏的平台所花时间(图5c)。图6a显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型，其特征在于：其基因型为Cdk13

【技术特征摘要】
1.一种人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型，其特征在于：其基因型为Cdk13+/-或者Cdk13-/-。


2.权利要求1所述的人CDK13发育缺陷综合症小鼠模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
一个构建Cdk13flox小鼠的步骤，将Cdk13第三、四外显子两侧分别带有LoxP位点的Cdk13tm1a(EUCOMM)HmguES细胞株扩增后注射进野生型小鼠囊胚，通过胚胎移植，获得F0代小鼠，F0代小鼠再与野生型小鼠交配，繁育获得F1代小鼠，其基因型为Cdk13F/+，所述的F1代小鼠在第三、四外显子两侧分别带有LoxP位点的Cdk13flox小鼠，即Cdk13flox小鼠；
一个制备Cdk13+/-敲除小鼠的步骤；将步骤1）构建的在第三、四外显子两侧分别带有LoxP位点的Cdk13flox小鼠先与Flp工具小鼠交配，获得的小鼠的基因型为Cdk13fl/+；FLP,然后再与野生型小鼠交配获得不带neo和Flp的子代Cdk13...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙方霖，孙峰，景园雅，张玮，
申请(专利权)人：同济大学青岛高等研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37