茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体公开了茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其应用，所述的引物组合如表1所示。本发明专利技术提供了522个MNP核心引物构成的引物组合可兼容二代测序平台，具备高效、正确、高重现性等特点，满足茄子标准指纹数据构建的要求；对茄子待测样本和对照品种鉴定，能够准确鉴定所述待测茄子样本的真实性；对茄子高代自交系材料分析显示，这个MNP位点具备高多态性和可重复性，能区分不同茄子类群，具有广泛的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其应用。技术背景茄子(SolanummelongenaL.)为茄科茄属蔬菜作物，在全球各地广为栽培，是世界第四大蔬菜作物，是我国的主要蔬菜作物之一。据联合国粮食及农业组织(FAO)2018年统计报道，全球茄子产量约为5千万吨，其中亚洲茄子占总产量的90％以上，中国年种植面积约为80万公顷，总产量占全球总产量的50％以上。我国是茄子的次生起源地，栽培历史悠久，种质资源丰富，国家种质中期库已搜集种质1468份。作物种质资源是种质创新和新品种选育的物质基础。据不完全文献统计，2011-2015年全国近50家单位共育成茄子新品品种74个，其中62个新品通过省、地方品种委员会审定、认定或鉴定。较大规模的茄子品种数量，增加了品种管理的难度，且近几年随着茄子品种商业化地发展，我国各地区茄子消费习惯的显著性正在逐渐下降，导致的种子资源日趋狭窄，在原品种的基础上的仅少数性状的派生新品种增多，品种间的遗传差异逐渐缩小，有效地管理和鉴定庞大的茄子品种成为品种管理的难题。传统的田间种植观察鉴定、蛋白电泳等方法，由于区分能力有限，已不能满足大样本、精确、快速鉴定的需要。DNA指纹鉴定技术由于不受环境和人为因素影响，且具有快速和准确的特性，已成为目前茄子鉴定的重要手段。DNA指纹是指不同品种间遗传物质DNA碱基的排列、组分和长度不同所呈现的各自特有的DNA序列，具有特异性。早期传统的DNA指纹鉴定技术有RFLP、RAPD、ISSR、SRAP标记法技术，这些标记具有分型不稳定、基因型过多无法分辨和非共显性等缺陷，基本上没有被纳入品种鉴定中。经过近几十年的发展，最终只有SSR和SNP标记鉴定技术被保留并应用品种鉴定中。SSR标记法的有主要优点是多态性高和共显性，可在普通实验室进行电泳检测。目前大部分的植物指纹图谱和品种鉴定标准都是基于SSR开发，但SSR标记法主要依据片段大小进行检测，为了进行品种比较，往往需要将待测样本与对照样本在同一电泳胶上进行平行检测。当涉及到大规模样本检测时，无法做到同时检测成百上千的已知品种，并且涉及到近似品种筛选、品种权认定和实质派生品种判断时，不具有现实的可行性。基于SSR标记法存在的问题，SNP标记法在近年来被逐步应用于植物品种鉴定中。SNP标记法主要是获得单个核苷酸酸碱基序列，因此不需要对照平行实验。然而SNP也有一些自身固有的缺陷，如SNP标记是二态性标记，单个标记区分能力有限，所以需要检测大量的SNP位点才能实现精确分型，因而设计到高通量芯片技术。基因芯片技术的生产工艺较为复杂，生产成本较高，不太适合普通实验和小作物等中使用，推广力度有限。MNP多态性是指在基因组水平上有多个核苷酸引起的多态性。MNP标记法技术主要是基于高通量测序技术开发的检测特定基因组上一段区域内的由多个核苷酸多肽性的标记法技术。与SSR标记和SNP标记法相比，MNP标记法在构建植物指纹图谱和品种鉴定方面具有以下优势：(1)等位基因丰富，单个MNP位点上有2n种等位基因，高于SSR和SNP；(2)MNP获得的是碱基序列，不需要平行对照实验；(3)MNP标记的等位基因型丰富，品种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现品种鉴定，减少了检测错误率；(4)可定量检测，基于MNP位点利用二代高通量测序重复抽样可对特定等位基因进行定量分析；(5)效率高，利用二代高通量测序仪可实现成百上千份样本的数百个MNP位点分型；(6)可进行实质性派生品种检测。鉴于以上优点和特性，MNP标记法已广泛应用于水稻、玉米、番茄、辣椒等作物中。目前在茄子中尚未有较为广泛应用的DNA指纹图谱以及品种鉴定标准，而MNP标记法的开发、筛选和应用在植物中具有较好的应用基础。MNP标记主要基于参考基因组序列开发，根据已报道的茄子重测数据和测得的差异性样本材料的重测序数据可以挖掘大规模的多态性MNP位点，再根据多态性MNP位点遗传多样性差异可筛选多态性最大、覆盖程度的最广的一套MNP位点，通过MNP位点两侧的保守序列可以设计MNP检测引物。根据研究目的不同MNP标记可筛选500至1000个左右即可完成大规模植物DNA指纹图图谱构建、真实性鉴定、遗传多样性分析、分子育种等工作。由于目前NCBI等数据库中公布的茄子重测序数据较少，阻碍了MNP位点的开发。因此，本专利技术基于已公布的茄子重测数据及获得的茄子重测数据，结合高通量测序技术开发了一套用于检测茄子多态性MNP标记位点的引物，并用于构建茄子DNA指纹图谱，相关MNP标记法引物适用于茄子真实性鉴定、遗传多样性分析、分子育种等领域。本专利技术在茄子领域属于首创，并未见相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合，所述的引物组合为位点编号AMPL3700001～AMPL3700522对应的引物。本专利技术的另一个目的在于提供了茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合，所述的引物组合为位点编号AMPL3700001～AMPL3700522对应的522对引物，具体的引物序列如具体实施方式中表1所示。茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合的应用，包括用于构建茄子DNA指纹数据库、检测茄子品种真实性、茄子种质资源遗传多样性分析或茄子分子育种；以上所述的应用中，当用于构建茄子DNA指纹数据库时，是利用本专利技术的引物组合对待测茄子品种的基因组DNA进行混合PCR扩增，522对MNP引物构成的组合加上二代测序接头引物和标签序列后对回收产物进行第二轮混合PCR扩增，对第二轮扩增产物回收和纯化后进行上机测序，测序结果比对回所述的茄子参考基因组上，获取上述茄子品种在所述522个MNP位点上的基因组数据，即构成茄子的DNA指纹数据库。以上所述的应用中，当用于检测茄子品种真实性时，利用所述的MNP引物对待测茄子样本和对照茄子样本的基因组DNA进行扩增和测序，从而获取待测茄子样本和对照茄子样本各自在522个MNP位点的基因型数据，若所述待测茄子品种与所述对照茄子品种在所述522个MNP位点上的基因型数据中的差异位点百分比大于等于5％，则说明两个茄子样本不属于同一品种；若所述待测茄子品种与所述对照茄子品种在所述522个MNP位点上的基因型数据中的差异位点百分比小于5％，则为同一品种或者候选同一品种。以上所述的应用中，茄子种质资源遗传多样性分析时，是分别提取待测种质资源群类划分的所有茄子品种的基因组DNA；利用所述的MNP引物对所述茄子品种的基因组DNA分别进行扩增和MNP位点查询，从而获得所有所述茄子品种在所述的522个MNP位点上的基因型数据；建立聚类树状图。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：实验证明，本专利技术提供的这个522个MNP位点检测引物，可兼容二代测序平台，具备高效、正确、高重现性等特点，满足茄子标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合，所述的引物组合为位点编号AMPL3700001~ AMPL3700522对应的522对引物，具体的引物序列如说明书表1所示。/n

【技术特征摘要】
1.茄子DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合，所述的引物组合为位点编号AMPL3700001~AMPL3700522对应的522对引物，具体的引物序列如说明书表1所示。


2.权利要求1所述的引物组合在构建茄子DNA指纹数据库中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪源，张敏，谈杰，黄树苹，陈霞，
申请(专利权)人：武汉市农业科学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42