一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用技术

本发明专利技术提供了一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR‑T细胞和应用，属于基因工程技术领域，所述mRNA的核苷酸序列选自SEQ ID No.1～4中的任一种；所述的编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列选自SEQ ID No.5～9中的一种或几种。采用本发明专利技术提供的编码CAR基因的mRNA、组合mRNA构建得到的CAR‑T细胞能够表达CAR基因，对肿瘤具有杀伤作用。

【技术实现步骤摘要】
一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用。
技术介绍
随着全球环境因素的不断恶化，无论发达国家还是发展中国家，恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势，恶性肿瘤已成为人类生命健康的最大危害。由于传统治疗方法的固有缺陷以及全球生物高新技术的火热发展，人们对新疗法的出现期待已久。而生物治疗作为刚崭露头角的全新治疗理念，其特有优点包括选择性靶向杀伤肿瘤细胞，对正常细胞无毒性作用。生物疗法治疗癌症能够明显改善患者临床症状，提高生活质量，延长生存期。生物疗法治疗癌症能激活机体免疫功能，有望根除肿瘤细胞，生物治疗能够增强手术成功率，必将为癌症患者所广泛接受。CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案。其通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。近几年，CAR-T疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得的成果是有目共睹的，如针对难治性/复发性急性B淋巴母细胞白血病的Kymriah和针对难治性/复发性非何杰金氏淋巴瘤的Yescarta去年已在美国上市，但会有至少50％以上的复发率，且CAR-T细胞治疗实体瘤效果不佳，主要原因是缺乏合适的靶抗原、CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫逃逸、免疫抑制肿瘤微环境等。因此，目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造的T细胞自身安全性来讲都至关重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用，采用本专利技术提供的编码CAR基因的mRNA和mRNA组合构建得到的CAR-T细胞，能够表达CAR基因，能够杀伤肿瘤细胞。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种编码CAR基因的mRNA，所述mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.1～4中的任一种。本专利技术还提供了一种防治肿瘤的组合mRNA，包括上述技术方案所述的编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.5～9中的一种或几种。优选的，包括编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。优选的，包括编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。优选的，包括编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.7和8所示。优选的，包括编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。本专利技术还提供了一种CAR-T细胞的构建方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的编码CAR基因的mRNA或上述技术方案所述的组合mRNA转染细胞，得到CAR-T细胞。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述的构建方法构建得到的CAR-T细胞。本专利技术还提供了上述技术方案所述的CAR-T细胞在制备防治肿瘤的药物中的应用。优选的，所述肿瘤包括人淋巴瘤。本专利技术提供了一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用，所述mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.1～4中的任一种；所述的编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.5～9中的一种或几种。本专利技术以编码CAR基因的mRNA或组合mRNA为抗原，不仅便于保存和运输，还可以在原位将T细胞转化成为CAR-T细胞，相比传统体外CAR-T制备在流程上大大简化，成本大幅下降。以信使RNA作为携带嵌合抗原受体的载体，转入患者T细胞后，将T细胞激活，并装上定位导航装置CAR(肿瘤嵌合抗原受体)，将T细胞这个普通"战士"改造成"超级战士"，即CAR-T细胞，他利用其"定位导航装置"CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。本专利技术实施例的结果显示：采用本专利技术提供的编码CAR基因的mRNA、组合mRNA构建得到的CAR-T细胞能够表达CAR基因，对肿瘤具有杀伤作用。附图说明图1为CAR-T细胞中CAR的表达率；图2为CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞结果；图3为CAR-T细胞被靶细胞激活后外泌IFNγ的结果；图4为CAR-T细胞被靶细胞激活后CD4和CD8细胞分泌IFNγ的结果。图5为CAR-T细胞被靶细胞激活后CD4和CD8细胞分泌IFNγ的结果。图6为CAR-T细胞被靶细胞激活后CD4和CD8细胞分泌IFNγ的结果。图7为注射CAR基因mRNA后原位构建CAR-T细胞的结果。图8为CAR-T细胞体内杀伤靶细胞的结果。具体实施方式本专利技术提供了一种编码CAR基因的mRNA，所述mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.1～4中的任一种。本专利技术还提供了一种防治肿瘤的组合mRNA，包括上述技术方案所述的编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.5～9中的一种或几种。在本专利技术中，核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的mRNA编码IL-2细胞因子，核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的mRNA编码IL-10细胞因子，核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的mRNA编码IL12A细胞因子，核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的mRNA编码IL12B细胞因子，核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的mRNA编码CCL-19细胞因子。在本专利技术中，所述编码IL-2细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。在本专利技术中，所述编码IL-10细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。在本专利技术中，编码IL12A细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。在本专利技术中，编码IL12B细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。在本专利技术中，所述编码CCL-19细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。在本专利技术中，所述的mRNA组合包括编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列优选如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码CAR基因的mRNA，其特征在于，所述mRNA的核苷酸序列选自SEQ ID No.1～4中的任一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种编码CAR基因的mRNA，其特征在于，所述mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.1～4中的任一种。


2.一种防治肿瘤的组合mRNA，其特征在于，包括权利要求1所述的编码CAR基因的mRNA和编码细胞因子的mRNA，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列选自SEQIDNo.5～9中的一种或几种。


3.根据权利要求2所述的组合mRNA，其特征在于，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。


4.根据权利要求2所述的组合mRNA，其特征在于，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述编码细胞因子的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。


5.根据权利要求2所述的组合mRNA，其特征在于，所述编码CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQIDNo...

【专利技术属性】
技术研发人员：张苗苗，洪丹，胡迅，
申请(专利权)人：深圳市瑞吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44