DaMT3b基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物领域，公开了DaMT3b基因及其应用。本发明专利技术首次克隆了参薯金属硫蛋白DaMT3b基因的全长cDNA，基因表达分析显示DaMT3b基因在叶片中特异性表达，受乙烯利及脱落酸诱导上调表达，同时该基因受低温和高度胁迫上调表达，机械伤害胁迫下调表达，因此该基因可能与参薯抗逆密切相关，可作为参薯转基因育种的重要靶基因。进一步将该基因转入原核表达菌株，转基因菌株在正常条件下、重金属离子(Cu

【技术实现步骤摘要】
DaMT3b基因及其应用
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种DaMT3b基因及其应用。
技术介绍
金属硫蛋白(metallothionein，MTs)是一类富含半胱氨酸(Cys)，能够与重金属结合的低分子(6-7kDa)多肽，普遍存在于微生物、高等动植物和人体中。根据目前已克隆得到的植物中金属硫蛋白基因Cys残基的分布和排列方式，可以分为Type1、Type2、Type3和Type4四类。四类金属硫蛋白基因具有组织特异性表达的特点，其中Type1主要在根中表达，Type2主要在叶子中表达，Type3主要在成熟的果实和叶中表达，Type4主要在种子中表达对植物中金属硫蛋白基因的功能研究表明，其功能主要体现在：(1)能够结合细胞内的重金属，维持细胞内重金属离子的生态平衡；(2)能够作为活性氧的清除剂，其清除自由基(·OH)的能力约为SOD的几千倍，而清除氧自由基(·O)的能力约是谷胱甘肽(GSH)的25倍，而且具有很强的抗氧化活动；(3)参与植物的生长和发育；(4)调控酶与转录因子活性等方面。参薯(DioscoreaalataL.)，又名大薯，也有称其为紫参薯(紫参薯花青素稳定性及合成途径中关键基因的克隆与分析，赵景梅，2018)，作为一种药食同源的粮食作物，在我国被主要用于食品、医药、工业及燃料乙醇生产等。近年来，尽管我国种植产业取得了较快发展，但受土壤重金属污染和非生物胁迫，植物的生长发育受到严重的影响。金属硫蛋白，作为一种具有重要生物学功能的蛋白，不但可以有效减轻重金属对植物的伤害，而且能够通过清除植物体内的活性氧提高植物对逆境的耐受性。因此研究参薯中的重金属硫蛋白有助于了解其提高参薯抗逆的作用机制。目前，参薯中金属硫蛋白基因的功能还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种DaMT3b基因及其应用。本专利技术的第一个方面是提供一种金属硫蛋白基因，其命名为DaMT3b基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的第二个方面是提供一种蛋白质，其为金属硫蛋白DaMT3b，是本专利技术第一个方面所述的金属硫蛋白基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的第三个方面是提供一种重组表达载体，其包含原始载体和本专利技术第一个方面所述的金属硫蛋白基因或其开放阅读框(SEQIDNO:1所示的第52-249位核苷酸序列)。其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本专利技术对此不进行限定。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pGEX-4T-1载体质粒或pMD18-T载体质粒，但应当理解的是，本专利技术还可以采用其他质粒、或者病毒等。优选地，所述原始载体为pGEX-4T-1载体质粒，SEQIDNO:1所示的第52-249位核苷酸序列位于pGEX-4T-1载体质粒的EcoRI和XhoI两限制性内切酶位点之间。本专利技术的第四个方面是提供如本专利技术第一个方面所述的金属硫蛋白基因、或者本专利技术第二个方面所述的蛋白质、或者本专利技术第三个方面所述的重组表达载体在提高原核表达菌株生长速度中的应用。其中，所述原核表达菌株可以是基因重组领域中常用的原核表达菌株，本专利技术对此不进行限定。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述原核表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第五个方面是提供如本专利技术第一个方面所述的金属硫蛋白基因、或者本专利技术第二个方面所述的蛋白质、或者本专利技术第三个方面所述的重组表达载体在提高原核表达菌株抗镉金属胁迫、和/或铜金属胁迫、和/或锌金属胁迫、和/或NaCl胁迫、和/或过氧化氢胁迫中的应用。其中，所述原核表达菌株可以是基因重组领域中常用的原核表达菌株，本专利技术对此不进行限定。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述原核表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第六个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。本专利技术的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示。本专利技术的第八个方面是提供一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示。本专利技术首次克隆了参薯金属硫蛋白DaMT3b基因的全长cDNA，基因表达分析显示DaMT3b基因在叶片中特异性表达，受乙烯利及脱落酸诱导上调表达，同时该基因受低温和高度胁迫上调表达，机械伤害胁迫下调表达，因此该基因可能与参薯抗逆密切相关，可作为参薯转基因育种的重要靶基因，有望通过调控该基因的表达来促进参薯的生长发育，从而最大潜力的挖掘参薯生产潜力。进一步将该基因转入原核表达菌株，转基因菌株在正常条件下、重金属离子(Cu2+、Cd2+、Zn2+)、NaCl胁迫和过氧化氢胁迫下的生长得到明显提高，所以该基因可作为重要的基因资源，可以在参薯以外的其他植物或微生物的抗逆和抗重金属胁迫基因工程中得到应用。附图说明图1为DaMT3b基因的组织特异性表达分析结果(块茎、零余子、叶、根、茎、花)。图2为低温处理对DaMT3b基因表达的影响。图3为高温处理对DaMT3b基因表达的影响。图4为机械伤害处理对DaMT3b基因表达的影响。图5为ABA处理对DaMT3b基因表达的影响。图6为乙烯利处理对DaMT3b基因表达的影响。图7为DaMT3b的原核表达分析(黑框内所示条带为受IPTG诱导后所产生的特异表达的目标蛋白)。图8为转基因大肠杆菌在培养基上生长情况(A：在正常条件下生长的OD600测定；B：在重金属镉离子胁迫下生长的OD600测定；C：在重金属铜离子胁迫下生长的OD600测定；D：在重金属锌离子胁迫下生长的OD600测定；E：在氯化钠胁迫下生长的OD600测定；F：在过氧化氢胁迫下生长的OD600测定)。具体实施方式我们首次克隆了参薯金属硫蛋白基因的全长cDNA，并进行了基因表达分析和功能研究，将该基因命名为DaMT3b。下面参照附图，结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，以更好地理解本专利技术。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过公司购得的常规产品。实施例1.金属硫蛋白及其编码基因的获得分析已在NCBI登陆的拟南芥、木薯和甘薯等的金属硫蛋白的核苷酸序列，通过搜索我们建立的参薯块茎和叶片EST序列数据库，筛选并拼接一条400bp左右的参薯金属硫蛋白基因组装后序列(contig)，设计一对特异性引物扩增得到包含完整读码框的cDNA全长序列。具体方法如下：特异性引物设计如下：F(5’端)：5’-AGTTCAATCGATCGCCTTT-3’；R(3’端)：5’-CTTAATACGAGACATGAGCACAC-3’。以参薯(DioscoreaalataL.；海南大学儋州校区薯蓣种质资源圃，编本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金属硫蛋白基因，其特征在于，其命名为DaMT3b基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种金属硫蛋白基因，其特征在于，其命名为DaMT3b基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.一种金属硫蛋白，其特征在于，其为金属硫蛋白DaMT3b，是权利要求1所述的金属硫蛋白基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.一种重组表达载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求1所述的金属硫蛋白基因或其开放阅读框。


4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述原始载体为pGEX-4T-1载体质粒，SEQIDNO:1所示的第52-249位核苷酸序列位于pGEX-4T-1载体质粒的EcoRI和XhoI两限制性内切酶位点之间。


5.如权利要求1所述的金属硫蛋白基因、或者权利要求2所述的蛋白质、或者权利要求3或4所述的重组表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亚成，刘林娅，高成密，黄东益，刘念念，刘迪，
申请(专利权)人：六盘水师范学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52