一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人AP‑2α基因的shRNA干扰序列及其制备与应用，其中靶向人AP‑2α基因的有效siRNA靶点序列为：5′‑TGAATTTCTCAACCGACAA‑3′，并通过构建人AP‑2α基因小分子干扰RNA、人AP‑2α基因干扰核酸构建体、人AP‑2α基因干扰慢病毒等过程，证明了人AP‑2α基因siRNA或含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人AP‑2α基因的表达，能够高效侵染靶细胞，高效率抑制靶细胞中AP‑2α基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列及其制备与应用
本专利技术涉及生物药物
，具体涉及一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列及其制备与应用。
技术介绍
近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达并诱导细胞表现出特定基因缺失的表型称为RNA干扰，siRNA就是这种短片段双链RNA分子，其能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定基因的mRNA。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程，现在越来越多的研究人员开始采用RNAi来研究生物体的基因表达，RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号传导通路分析及疾病基因治疗等等；转录因子AP-2α属于AP-2(activatingprotein2)家族，其包括AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和AP-2ε五个亚型；AP-2家族在调节细胞增殖、分化和凋亡以及哺乳动物的胚胎发育中起到重要作用。近年来,AP-2家族在肿瘤发生发展中的作用也日益受到关注。研究表明，AP-2的调节效应可能是双向作用即抑癌或促癌作用,与组织特异性、时相性以及各亚型之间差异性等相关；在AP-2家族中,AP-2α发现最早,AP-2α表达下降与胃腺癌患者的不良预后有关，而在胰腺癌细胞和横纹肌肉瘤表达高水平AP-2α，在乳腺癌中AP-2α表达上调与erbB-2过表达呈显著正相关联,提示AP-2α可能参与erbB-2诱导的乳腺癌发生；在结肠癌细胞中，AP-2α是以肿瘤抑制基因的角色发挥作用，由此提示AP-2α在不同类型的肿瘤中的作用不同；有文献报道，在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和CasKi中都表达AP-2α蛋白；而在现有技术中，还没有关于AP-2αRNAi载体的构建方法方面的报道。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供人AP-2α基因的shRNA序列及其干扰慢病毒的构建方法，通过构建人AP-2α基因小分子干扰RNA、人AP-2α基因干扰核酸构建体、人AP-2α基因干扰慢病毒等过程，证明了AP-2α基因siRNA或含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人AP-2α基因的表达，能够高效侵染靶细胞，高效率抑制靶细胞中AP-2α基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列，包括DNAoligo正链序列与反链序列；其中：正链序列为:5′-tgcTGAATTTCTCAACCGACAActcgagTTGTCGGTTGAGAAATTCAgcttttttc-3′；反链序列为：5′-tcgagaaaaaagcTGAATTTCTCAACCGACAActcgagTTGTCGGTTGAGAAATTCAgca-3′。一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列的构建方法，所述方法包括：S1.设计合成针对人AP-2α基因的有效的siRNA靶点，得到靶向人AP-2α基因的有效siRNA靶点序列为：5′-TGAATTTCTCAACCGACAA-3′；S2.利用siRNA靶点合成人AP-2α基因的DNAoligo干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建，同时在正链3’端添加TTTTT终止信号，反链5’端添加终止信号互补序列，合成单链DNAoligo；S3.将单链DNAoligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNAoligo。一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列构建慢病毒的应用，利用人AP-2α基因的shRNA干扰序列构建慢病毒的具体过程为：S1.通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人AP-2α基因的shRNA干扰序列的双链DNA连接；S2.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；S3.质粒抽提，病毒包装；S4.利用得到的慢病毒对AP-2α基因的沉默效率进行检测。优选的，步骤S1所述的通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人AP-2α基因的shRNA干扰序列的双链DNA连接的具体过程包括：S101线性化载体制备(1)按41μl的ddH2O、5μl的10×CutSmartBuffer、2μl的纯化的质粒DNA(1μg/μL)、1μl的HpaI(10U/μl)酶、1μl的XhoI(10U/μl)酶的添加顺序配制50μl酶切反应体系，然后用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜，得到载体酶切产物；(2)对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，使其线性化，并于37℃反应1h，之后切胶回收目的片段；S102连接(1)按1μl的线性化载体DNA100ng/μl、1μl的DNAoligo100ng/μl、2μl的10×T4噬菌体DNA连接酶buffer、1μl的T4噬菌体DNA连接酶和15μl的ddH2O的加入顺序配制连接反应体系；(2)并将该连接反应体系于16℃连接过夜，即实现将线性化载体与人AP-2α基因的shRNA干扰序列的双链DNA连接。优选的，步骤S2所述的将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定的具体过程包括：S201用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞；S202利用步骤S102得到的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；S203对已转化的感受态细胞进行阳性克隆PCR鉴定。优选的，步骤S203所述的对已转化的感受态细胞进行阳性克隆PCR鉴定的具体过程包括:(1)RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定取转化子重悬于10μlLB溶液，混匀取1μl作为模板；使用GV118通用引物，设计鉴定引物，并进行菌落PCR鉴定实验；(2)进行PCR扩增配置20μlPCR反应体系：包括2μl10×buffer，0.8μldNTPs(2.5mM)，0.4μlPrimer(+)，0.4μlPrimer(-)，0.2μlTaqpolymerase，1μlDNA模板，15.2μlddH2O；然后进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30次循环；72℃6min；(3)PCR结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带，并对扩增得到的检测到呈阳性的TFAP2A-RNAi(36379)进行测序。优选的，步骤(1)所设计得到的鉴定引物为：鉴定引物-F：Primer1:5’-GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3’；鉴定引物-R:Primer2:5’-GAGGCCAGATCTTGGGTG-3’。优选的，步骤(3)测序得到的TFAP2A-RNAi(363本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列，其特征在于：包括DNAoligo正链序列与反链序列；/n其中：正链序列为:/n5′-tgcTGAATTTCTCAACCGACAActcgagTTGTCGGTTGAGAAATTCAgcttttttc-3′；/n反链序列为：/n5′-tcgagaaaaaagcTGAATTTCTCAACCGACAActcgagTTGTCGGTTGAGAAATTCAgca-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列，其特征在于：包括DNAoligo正链序列与反链序列；
其中：正链序列为:
5′-tgcTGAATTTCTCAACCGACAActcgagTTGTCGGTTGAGAAATTCAgcttttttc-3′；
反链序列为：
5′-tcgagaaaaaagcTGAATTTCTCAACCGACAActcgagTTGTCGGTTGAGAAATTCAgca-3′。


2.根据权利要求1所述的一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列的构建方法，其特征在于：所述方法包括：
S1.设计合成针对人AP-2α基因的有效的siRNA靶点，得到靶向人AP-2α基因的有效siRNA靶点序列为：5′-TGAATTTCTCAACCGACAA-3′；
S2.利用siRNA靶点合成人AP-2α基因的DNAoligo干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建，同时在正链3’端添加TTTTT终止信号，反链5’端添加终止信号互补序列，合成单链DNAoligo；
S3.将单链DNAoligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNAoligo。


3.根据权利要求1所述的一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列构建慢病毒的应用，其特征在于：利用人AP-2α基因的shRNA干扰序列构建慢病毒的具体过程为：
S1.通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人AP-2α基因的shRNA干扰序列的双链DNA连接；
S2.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；
S3.质粒抽提，病毒包装；
S4.利用得到的慢病毒对AP-2α基因的沉默效率进行检测。


4.根据权利要求3所述的一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列构建慢病毒的应用，其特征在于：步骤S1所述的通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人AP-2α基因的shRNA干扰序列的双链DNA连接的具体过程包括：
S101线性化载体制备
(1)按41μl的ddH2O、5μl的10×CutSmartBuffer、2μl的纯化的质粒DNA(1μg/μL)、1μl的HpaI(10U/μl)酶、1μl的XhoI(10U/μl)酶的添加顺序配制50μl酶切反应体系，然后用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜，得到载体酶切产物；
(2)对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，使其线性化，并于37℃反应1h，之后切胶回收目的片段；
S102连接
(1)按1μl的线性化载体DNA100ng/μl、1μl的DNAoligo100ng/μl、2μl的10×T4噬菌体DNA连接酶buffer、1μl的T4噬菌体DNA连接酶和15μl的ddH2O的加入顺序配制连接反应体系；
(2)并将该连接反应体系于16℃连接过夜，即实现将线性化载体与人AP-2α基因的shRNA干扰序列的双链DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文康，姜向阳，施瑞洁，解娟，李玲，王银坤，迟洁，
申请(专利权)人：陕西省人民医院，
类型：发明
国别省市：陕西;61