制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，制备步骤如下：构建工程菌Escherichia coli CKI‑CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶；构建工程菌Escherichia coli PPK‑UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶；构建工程菌Escherichia coli CMK‑NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶；对发酵得到的产酶细胞进行破碎，离心收集上清液得到粗酶液。本发明专利技术首次报道了具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶可以用于胞二磷胆碱的合成，具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的异源可溶性表达量和酶活力更高。

【技术实现步骤摘要】
制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法
本专利技术属于化合物生物
，尤其是一种制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法。
技术介绍
胞二磷胆碱是生物体中卵磷脂合成的重要前体。胞二磷胆碱由日本武田药品工业公司首先开发成功，商品名称为“Nicholin””(尼可林)，现已被中国药典收录作为细胞代谢改善药。胞二磷胆碱是临床用量最大的神经激活剂，能促进卵磷脂的生物合成，恢复神经组织功能，改善脑代谢和循环，可用于急性颅脑外伤和脑手术所引起的意识障碍恢复，并可用于帕金森综合征和老年性痴呆症的辅助治疗。胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。现有胞二磷胆碱的制备方法主要为化学合成法。通用的方法是采用cytidine-5’-phospho-morpholide和磷酸胆碱盐酸盐在乙腈或吡啶中缩合形成胞二磷胆碱。其中，cytidine-5’-phospho-morpholide可以通过CMP和吗啉在DCC中脱水缩合(ChemicalandPharmaceuticalBulletin,1971,19(5):1011–1016.)或者通过选择性磷酸化胞苷(JournalofChemicalResearch,2016,40(6):358–360.)的方法获得。然而，上述合成路线中使用的原料和缩合剂价格昂贵，而且需要在有毒的有机溶剂中完成反应，导致胞二磷胆碱的合成收率较低，生产成本居高不下。近年国内大部分的生产多报道为生物转化，以各种微生物为生物催化剂，利用其中的磷酸胆碱胞苷转移酶(Cholinephosphatecytidylyltransferase，CCT，EC2.7.7.15)，以胞苷三磷酸(Cytidinetriphosphate，CTP)和磷酸胆碱为底物可直接合成胞二磷胆碱，具有反应条件温和、成本低和工艺简便等特点，但也存在转化率低、产品纯度低和生产规模小等问题。詹谷宇等(中国医药工业杂志,1987,18(6):252–255.)以异常汉逊酵母的静息细胞为生物催化剂，用胞苷酸(Cytidinemonophosphate，CMP)和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201210066604.7报道了用简单原料碳、氮源，在含有多微生物培养液中生物合成CMP，并累积生成胞二磷胆碱。随分子生物学技术的发展，基因工程技术成为改良产胞二磷胆碱菌株的新手段。专利201310167034.5报道利用大肠杆菌工程菌异源表达CCT酶并固定化，以磷酸胆碱和CTP为原料生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201510702581.8报道用经改造的基因工程大肠杆菌菌株作为生物催化剂，用乳清酸和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱。邓童心等(药物生物技术,2018,25(04):294–298.)通过在酵母中过表达反应关键酶CCT酶而提高胞二磷胆碱的转化率和产量，以CMP和磷酸胆碱为原料，生物转化制造胞二磷胆碱，反应7h摩尔转化率可高达73.1％。在生物法制备胞二磷胆碱方面，国外主要采用多酶催化体系，通过不同的反应途径获得目标产物。例如，在普遍使用的CMP-葡萄糖-酿酒酵母(CGS)途径中，以CMP、葡萄糖和氯化胆碱(或磷酸胆碱)为底物，使用透性化的酿酒酵母细胞将CMP和胆碱转化为胞二磷胆碱(JournalofFermentationTechnology,1974,52:637–645)，并通过糖酵解途径为反应不断地提供ATP(BioresourceTechnology,2009,100(20):4848–4853.)，产物的最大积累量、摩尔得率以及反应速率分别达到26.9mM、82.3％以及1.11mmol﹒L-1﹒h-1(BioresourceTechnology,2010,101(22):8807–8813)。在乳清酸-葡萄糖-产氨棒杆菌-大肠杆菌(OGCE)途径中，以乳清酸和氯化胆碱作为催化底物，首先使用透性化的产氨棒杆菌细胞将乳清酸转化为UTP并将葡萄糖分解产生ATP，再使用重组大肠杆菌过表达CTP合成酶(CTPS)、磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)以及胆碱激酶(CKI)将UTP和氯化胆碱转化为胞二磷胆碱，产物的积累量、摩尔得率以及反应速率分别达到21.6mM、45.7％以及0.94mmol﹒L-1﹒h-1(JournaloftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan,1997,61(6):956–959)。鉴于现有的化学法存在有毒试剂与合成收率低的问题，而多酶催化法存在原料成本过高、转化率和反应速率低等问题，特提出本专利申请。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，制备步骤如下：首先，构建工程菌EscherichiacoliCKI-CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和CTP形成胞二磷胆碱；构建工程菌EscherichiacoliPPK-UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化ATP再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成CMP；构建工程菌EscherichiacoliCMK-NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化CMP形成CDP，二磷酸核苷激酶能够用于催化CDP形成CTP；其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂。而且，具体制备步骤如下：⑴在大肠杆菌E.coliBL21(ACCC11171)中表达异源的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株EscherichiacoliCKI-CCT；⑵在大肠杆菌E.coliBL21(ACCC11171)中表达异源的聚磷酸激酶和胞苷激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株EscherichiacoliPPK-UDK；⑶在大肠杆菌E.coliBL21(ACCC11171)中表达内源的胞苷酸激酶和二磷酸激酶编码基因，构建出具有胞苷酸激酶和二磷酸激酶活性的菌株EscherichiacoliCMK-NDK；⑷将上述构建的重组菌株EscherichiacoliCKI-CCT、EscherichiacoliPPK-UDK和EscherichiacoliCMK-NDK分别在培养基中培养，诱导产生高酶活性的胆碱激酶、磷酸胆碱胞苷转移酶、聚磷酸激酶、胞苷激酶、二磷酸激酶和胞苷酸激酶，离心收集产酶细胞；⑸将步骤⑷中培养获得的产酶细胞Escherich本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：制备步骤如下：/n首先，构建工程菌Escherichia coli CKI-CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和CTP形成胞二磷胆碱；构建工程菌Escherichia coli PPK-UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化ATP再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成CMP；构建工程菌Escherichia coli CMK-NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化CMP形成CDP，二磷酸核苷激酶能够用于催化CDP形成CTP；/n其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：制备步骤如下：
首先，构建工程菌EscherichiacoliCKI-CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和CTP形成胞二磷胆碱；构建工程菌EscherichiacoliPPK-UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化ATP再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成CMP；构建工程菌EscherichiacoliCMK-NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化CMP形成CDP，二磷酸核苷激酶能够用于催化CDP形成CTP；
其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂。


2.根据权利要求1所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：具体制备步骤如下：
⑴在大肠杆菌E.coliBL21中表达异源的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株EscherichiacoliCKI-CCT；
⑵在大肠杆菌E.coliBL21中表达异源的聚磷酸激酶和胞苷激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株EscherichiacoliPPK-UDK；
⑶在大肠杆菌E.coliBL21中表达内源的胞苷酸激酶和二磷酸激酶编码基因，构建出具有胞苷酸激酶和二磷酸激酶活性的菌株EscherichiacoliCMK-NDK；
⑷将上述构建的重组菌株EscherichiacoliCKI-CCT、EscherichiacoliPPK-UDK和EscherichiacoliCMK-NDK分别在培养基中培养，诱导产生高酶活性的胆碱激酶、磷酸胆碱胞苷转移酶、聚磷酸激酶、胞苷激酶、二磷酸激酶和胞苷酸激酶，离心收集产酶细胞；
⑸将步骤⑷中培养获得的产酶细胞EscherichiacoliCKI-CCT、EscherichiacoliPPK-UDK和EscherichiacoliCMK-NDK重悬于平衡缓冲液中并进行细胞破碎，破碎液经13000r/min离心20min后取上清液，即为粗酶液。


3.根据权利要求2所述的制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：所述步骤⑴中是以pET-Duet质粒为载体在E.coliBL21中过表达胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株E.coliCKI-CCT；其中，所述胆碱激酶编码基因来源于具核梭杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2；所述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因来源于具核梭杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；所述质粒pET-Duet的核苷酸序列为SEQIDNO.13；
所述步骤⑵中是以pET-Duet质粒为载体在E.coliBL21中过表达聚磷酸激酶和胞苷激酶基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株E.coliPPK-UDK；其中，所述聚磷酸激酶编码基因来源于类球红细菌，其扩增引物为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6；所述胞苷激酶编码基因来源于嗜热栖热菌，其扩增引物为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8；所述质粒pET-Duet的核苷酸序列为SEQIDNO.13；
所述步骤⑶中是以pET-Duet质粒为载体在E.coliBL21中过表达胞苷酸激酶和二磷酸激酶基因，构建出具有胞苷酸激酶活性和二磷酸激酶活性的菌株E.coliCMK-NDK；其中，所述胞苷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.9、SEQIDNO.10；所述二磷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.11、SEQIDNO.12；所述质粒pET-Du...

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓光，胡晨龙，宋雪静，安俊侠，谢希贤，徐庆阳，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12