本发明专利技术提供了一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用。该ω转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，ω转氨酶突变体由ω转氨酶的氨基酸序列突变得到，与SEQ ID No：2具有至少90％的同源性。本发明专利技术从瘤状伯克霍尔德菌中提取了ω转氨酶基因，实现了该ω转氨酶基因的异源表达，所产生的ω转氨酶菌株对一系列芳基烷基类底物展示了优良的催化活性。本发明专利技术还将该ω转氨酶进行突变获得一系列ω转氨酶突变体，通过将该ω转氨酶突变体偶联不同的酶，应用于生物酶法不对称合成(S)‑1‑苯丙胺和其它手性胺类产品的生产中，具有经济环保、手性选择性高的特点，为转氨酶的工业应用提供了一个潜在的选择。
【技术实现步骤摘要】
一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用
本专利技术涉及生物工程
，更具体地涉及一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用。
技术介绍
目前，世界上95％的药物都是手性药物，其中70％的手性药物都需要用到手性胺作为手性前体去合成下一步的目标产物。主流的合成手性胺的方法依然是化学法，或者生物化学法相结合。然而，近年来，国家对于化学合成的监管力度愈加严格，相应的，生物制造行业正被大力扶持，这是由于化学法其本身苛刻的合成条件的危险性以及后期排污对于环境造成的严重污染所致的局面。特别是对于手性药物或者手性砌块的合成，大多数情况下，为了提高目标产物的立体选择性，会使用到贵重的循环利用率低的重金属或者过渡态金属，以此来提高所需要的光学纯的手性胺的比率。这种提高立体选择性的方式，无疑对后期的排污工作造成了巨大的经济损失，更重要的是对可持续型平衡型环境的不可逆破坏。因此，建立更加高效的环保的生产手性产品的生态友好型方法，迫在眉睫。生物法由于其温和的反应条件、简单的反应组分、极高的立体选择性和环境友好特性，引起了广泛的关注。相比于化学法冗长的反应链，生物法所使用的原料更加简单，步骤更加简短，特别是催化剂的使用，是具有生物相容性的酵素，在食品和医药领域具有很大的优势。生物法合成手性胺的方式也有很多种，包括脂肪酶的拆分、酰胺酶的水解、胺脱氢酶的胺化、腈水解酶的水解和转氨酶的拆分以及不对称合成等。本文所使用到的转氨酶主要指的是第一类或第四类PLP酶(5’-磷酸吡哆醛依赖型酶)。在转氨反应中，氨基供体首先和PLP(磷酸吡哆醛)共价结合形成磷酸吡多胺(PMP)，随后PMP把氨基转移给含有羰基的氨基受体，由此完成转氨反应和辅酶的循环(图1中的a所示)。转氨酶催化合成手性胺的方式主要有两种，第一种是去消旋化的拆分，由外消旋的胺经拆分形成具有单一光学纯度的S或者R型胺，理论转化率只有50％(图1中的b所示)；第二种是不对称还原胺化，由前体酮直接不对称胺化生成光学纯的胺类产物，理论转化率可以达到100％(图1中的c所示)。基于原料利用率的考虑，不对称胺化自然而然的成为了更受青睐的合成方案。例如，近些年来最成功的转氨酶工业化应用案例就是抗糖尿病药物西塔列汀(Merck公司及Codexis公司)的生物酶法合成，该过程使用的催化剂正是第四类PLP依赖性酶(R)-ω-转氨酶ATA-117及一系列突变体，这些突变体菌株催化的不对称还原是由西塔列汀前体酮一步生成光学纯的(R)-西塔列汀，其温和的反应条件相比于使用到钋和铑等过渡态金属的化学法，具有很大的优势，该生物过程也获得了2010年美国总统绿色化学挑战奖。光学纯的(S)-1-苯丙胺是重要的抗抑郁药I型促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂(CRF-Ⅰ)的手性前体。对应的前体酮1-苯丙酮为芳基烷基类底物，而且其小取代基是一个大于甲基的基团(乙基)。转氨酶之所以立体选择性高，正是基于其严格的大小口袋作用机制，而天然的转氨酶其小口袋一般很难容纳超过一个甲基的小基团，特别是大集团还是芳基类的衍生物，空间位阻的阻碍效应显得尤为明显。目前所报道的天然的对该底物具有催化活性的S型转氨酶例如OATA和PDTA等，对1-苯丙酮的催化活力也是极低。而经过改造的突变株对该底物的催化活性虽然提高了，但是转化效率并不高，例如经过改造的PDTA在催化4.2mM的1-苯丙酮时，反应时间为3天，转化率也只有79％，虽然其e.e.值大于99％。目前该抗抑郁药的合成路线主要还是以化学合成法来进行。所以生物催化转化法制备(S)-1-苯丙胺具有良好的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用，从而解决现有技术中制备手性胺的生物酶的缺失。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：根据本专利技术的第一方面，提供一种ω转氨酶，所述ω转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示，碱基序列如SEQIDNo：1所示。所述ω转氨酶BPTA来源于DSMZ17167瘤状伯克霍尔德菌(BurkholderiaphymatumSTM815)。根据本专利技术的第二方面，提供一种ω转氨酶突变体，所述ω转氨酶突变体的氨基酸序列由SEQIDNo：2所示的ω转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，所述ω转氨酶突变体与SEQIDNo：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。进一步优选地，所述ω转氨酶突变体与SEQIDNo：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。根据本专利技术的优选方案，该ω转氨酶突变体发生所述突变的氨基酸位点包括：第78位氨基酸位点，第82位氨基酸位点，第284位氨基酸位点，第440位氨基酸位点中的至少一个。具体地，78位的甲硫氨酸M可以突变成苯丙氨酸F、色氨酸W、异亮氨酸I、亮氨酸L、缬氨酸V、丙氨酸A，优选的，是突变成苯丙氨酸F。82位的色氨酸W可以突变成丙氨酸A、甲硫氨酸M、异亮氨酸I、亮氨酸L、缬氨酸V和甘氨酸G，优选的，是突变成丙氨酸A。284位的异亮氨酸I可以突变成苯丙氨酸F、色氨酸W、甲硫氨酸M、亮氨酸L、缬氨酸V、丙氨酸A，优选的，是突变成苯丙氨酸F。440位的苏氨酸T可以突变成谷氨酰胺Q、甲硫氨酸M、异亮氨酸I、亮氨酸L、缬氨酸V、丙氨酸A、半胱氨酸C和天冬酰胺N，优选的，是突变成谷氨酰胺Q。根据本专利技术的另一优选方案，所述ω转氨酶突变体包括：BPTAW82A，BPTAW82A/M78F，BPTAW82A/I284F，BPTAW82A/T440Q，BPTAM78F/W82A/I284F/T440Q中的任意一种。其中，BPTAW82A即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A所获得的ω转氨酶突变体，BPTAW82A/M78F即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、78位的甲硫氨酸M突变成苯丙氨酸F所获得的ω转氨酶突变体，BPTAW82A/I284F即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、284位的异亮氨酸I突变成苯丙氨酸F所获得的ω转氨酶突变体，BPTAW82A/T440Q即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、440位的苏氨酸T突变成谷氨酰胺Q所获得的ω转氨酶突变体，BPTAM78F/W82A/I284F/T440Q即为78位的甲硫氨酸M突变成苯丙氨酸F、82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、284位的异亮氨酸I突变成苯丙氨酸、440位的苏氨酸T突变成谷氨酰胺Q所获得的ω转氨酶突变体。根据本专利技术的第三方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒由SEQIDNo：2所示的ω转氨酶的编码序列与表达载体质粒连接构建而成，或者由如上所述的ω转氨酶突变体的编码序列与表达载体质粒连接构建而成。表达质粒可以是pET系列、pQE系列、pRSET系列、pGEX系列、pBV系列、pTrc系列、pTwin系列、pEZZ系列、pKK系列以及pUC系列，优选地，该表达载体质粒为pET-28a(+)，构成重组质粒bpta-pET-28a(+)。根据本专利技术的第四方面，提供一种ω转氨酶基因工程菌，所述ω转氨酶基因工程菌表达如上所述的ω本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ω转氨酶，其特征在于，所述ω转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种ω转氨酶，其特征在于，所述ω转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。
2.一种ω转氨酶突变体，其特征在于，所述ω转氨酶突变体的氨基酸序列由权利要求1所述的ω转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，所述ω转氨酶突变体与SEQIDNo：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。
3.根据权利要求2所述的ω转氨酶突变体，其特征在于，所述ω转氨酶突变体与SEQIDNo：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。
4.根据权利要求3所述的ω转氨酶突变体，其特征在于，发生所述突变的氨基酸位点包括：第78位氨基酸位点，第82位氨基酸位点，第284位氨基酸位点，第440位氨基酸位点中的至少一个。
5.根据权利要求4所述的ω转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体包括：BPTAW82A，BPTAW82A/M78F，BPTAW82A/I284F，BPTAW82A/T440Q，BPTAM78F/W82A/I284F/T440Q中的任意一种。
6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由根据权利要求1所述的ω转氨酶的编码序列与表达载体质粒连接构建而成，或者由根据权利要求2～5中任意一项所述的ω转氨酶突变体的编码序列与表达载体质粒连接构建而成。
7.一种ω转氨酶基因工程菌，其特征在于，所述ω转氨酶基因工程菌表达如权利要求1所述的ω转氨酶，或如权利要求2～5中任意一项所述的ω转氨酶突变体。
8.一种如权利要求1所述的ω转氨酶及权利要求2～5所述的ω转氨酶突变体在合成手性胺类产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王华磊，魏东芝，谢有余，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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