利用维生素B制造技术

本发明专利技术涉及一种发酵制备葡萄糖脱氢酶的方法，特别是指一种利用维生素B

【技术实现步骤摘要】
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法
本专利技术涉及一种发酵制备葡萄糖脱氢酶的方法，特别是指一种利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法。
技术介绍
FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-dependentglucosedehydrogenase，简称FAD-GDH，EC1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(GOD)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而GDH不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，因此GDH被认为是代替GOD的最具潜力的检测用酶。申请号为201710949621.8的专利技术专利申请中公开了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和，通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化，人工合成基因片段，构建重组表达载体pMD-GDH，转化毕赤酵母X33菌株(CGMCCNo.14382)后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。在10L发酵罐培养时经过136小时诱导培养，产量为257600U/L。通常通过改进发酵工艺，来提高产量。辅因子对细胞生长和胞内物质代谢至关重要。发酵液中的溶氧水平与微生物细胞内的NADH/NAD+比率也有密切关系。同时，微生物胞外氧化还原态势能够影响微生物胞内的NADH/NAD+的比率。维生素B2是一种非常重要的辅酶，是合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体物质。FMN和FAD是黄素酶-NADH脱氢酶的重要组成部分，作为呼吸链的组成成分，与糖、脂和氨基酸的代谢密切相关。维生素B2是NADH脱氢酶的重要组成部分。理论上维生素B2可以通过调节微生物胞内NADH脱氢酶活性进而调节胞内的NADH/NAD+比率，但利用外源添加维生素B2来提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的报道尚未见到。
技术实现思路
本专利技术提出一种利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，通过外源添加维生素B2后能够提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量。本专利技术的整体技术构思是：利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：A、菌株培养阶段接种量为10％～15％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4～4.5mLPTM1，在温度为28℃～30℃、搅拌转速为600～700转/分钟、pH＝4.8～5.2、通风量为1.2～2.0vvm的条件下通气搅拌培养l8～24小时；B、碳源饲喂阶段当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10～14mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12～16mL/h/L，流加时间为4～6小时；C、饥饿饲喂阶段至OD600≈160～180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；D、诱导表达阶段流加包含10～14mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％～0.3％左右，控制pH＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.5mM～1mM，当酶活不再升高时停止发酵。本专利技术的具体技术构思还有：为便于实现工业化生产，优选的技术实现手段是，还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris制成种子液。优选的一级种子的制备方法是将保藏编号为CGMCCNo.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为28～30℃、震荡速率为200～250转/分钟的条件下振荡培养12～16小时制成一级种子。优选的种子液的制备方法是，按体积比为3％～5％接种量将一级种子转接于80～120mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为200～250转/分钟的条件下培养6～10小时，至OD600≈6～8制成种子液。优选的发酵培养液的装量为，发酵培养液在反应釜中的装量为45％～56％。所述的步骤A、D中调整pH采用浓氨水。为更好地控制反应的终点，提高工业化生产的经济性，优选的技术实现手段是，步骤D中每隔12小时取样一次检测OD600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。为验证本专利技术的技术效果，申请人采用如下方法：酶活检测：毕赤酵母菌经8000转/分钟离心5分钟收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力，具体方法如下：DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH＝5.5，300μMDCIP和100mM葡萄糖。具体如下：1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/LDCIP100μl、酶液100μl；2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；3、计算公式：酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。酶活测定方法参见SygmundC，StaudiglP，KlausbergerM，etal.HeterologousoverexpressionofGlomerellacingulataFAD-dependentglucosedehydrogenaseinEscherichiacoliandPichiapastoris[J].MicrobialCellFactories，10，1(2011-12-12)，2011，10(1):1-9.本专利技术所具备的实质性特点及取得的技术进步在于：本专利技术采用外源添加维生素B2，培养108小时后FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量比对照组提高34.55％(最高可达40.39％)，对同体积的发酵液而言，FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量得到提高。实验结果还显示外源添加维生素B2后可以延长诱导培养时间至132小时，不外源添加维生素B2时，诱导108小时后酶活开始降低，诱导培养132小时后产量大于620000U/L(最高可达718840U/L)；实现同体积发酵液获得更高的产量。所以外源添加维生素B2后能够显著提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步描述，但不应理解为对本专利技术的限定，本专利技术的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本专利技术的保护范围。实施例1利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用维生素B

【技术特征摘要】
1.利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；其特征在于包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为10％～15％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4～4.5mLPTM1，在温度为28℃～30℃、搅拌转速为600～700转/分钟、pH＝4.8～5.2、通风量为1.2～2.0vvm的条件下通气搅拌培养l8～24小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10～14mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12～16mL/h/L，流加时间为4～6小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈160～180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含10～14mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％～0.3％左右，控制pH＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.5mM～1mM，当酶活不再升高时停止发酵。


2.根据权利要求1所述的利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCCNO.14382...

【专利技术属性】
技术研发人员：董聪，高庆华，罗同阳，王玥，王庆庆，马金国，樊晓东，马清河，秦艳梅，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13