一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法技术

本发明专利技术公开了一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法。该方法包括如下步骤：取含有番茄红素的发酵液，收集菌体；向菌体加入乙醇浸泡1‑3h，收集沉淀；用乙醇洗涤沉淀2次以上，收集菌粉；用50‑60℃乙酸乙酯萃取菌粉2‑4次，合并乙酸乙酯相，得到有机相；将有机相浓缩；然后加入乙醇，0‑4℃结晶，得到番茄红素晶体。采用本发明专利技术提供的方法从发酵液中分离提取番茄红素，纯度可达98％以上，收率可达75％以上。该方法分离纯化过程简单，产品纯度高，成本低，适合连续生产，符合工业化要求。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法
本专利技术属于生化分离
，具体涉及一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法。
技术介绍
番茄红素是一种长链不饱和烯烃，类胡萝卜素的一种，它的抗氧化能力是β-胡萝卜素的3.2倍，是维生素E的100倍，能高效淬灭人体中的单线态氧和清除自由基，从而起到抗癌、抑癌作用及活化免疫细胞等功能，被称为“植物黄金”。目前，番茄红素主要从植物中萃取，自然界植物以番茄中番茄红素含量最高，但含量也仅有约100mg/kg，大规模提取番茄红素会造成植物资源大量浪费，且植物成分复杂，造成提取产物纯度不高。因此，综合考虑到品质、技术、生产、资源成本等因素，从天然番茄中提取生产番茄红素的前景并不乐观。通过Wittig烯化反应可以人工合成番茄红素，但化学合成法工艺路线较长，反应条件比较苛刻，收率较低，同时产品带有大量的有毒物质残余，对食品安全产生很大影响。微生物有生长繁殖快，生长周期短，产量高，杂质少，可以进行大规模生产的特点，可以克服番茄提取和化学法合成番茄红素的不足之处，非常适合用于工业化生产；其培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高。
技术实现思路
本专利技术的目的是从发酵液中分离提取番茄红素。本专利技术首先保护一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法，依次包括如下步骤：(1)取含有番茄红素的发酵液，收集菌体；(2)取步骤(1)得到的菌体，加入乙醇浸泡1-3h(如1-2h、2-3h、1h、2h或3h)，收集沉淀；(3)用乙醇洗涤步骤(2)收集的沉淀2次以上(如2次、3次)，收集菌粉；(4)取步骤(3)得到的菌粉，用50-60℃(如50-55℃、55-60℃、50℃、55℃或60℃)乙酸乙酯萃取2-4次(如2-3次、3-4次、2次、3次或4次)，合并乙酸乙酯相，得到有机相；(5)将步骤(4)得到的有机相进行浓缩；然后加入乙醇，0-4℃(如0-2℃、2-4℃、0℃、2℃或4℃)结晶，得到番茄红素晶体。上述方法中，所述步骤(1)中，收集菌体的方式可为离心或过滤。上述方法中，所述步骤(2)中，收集沉淀的方式可为离心或过滤。离心可为管式离心机离心或碟片式离心机离心。离心速度不低于8000rpm。过滤可为板框过滤。上述方法中，所述步骤(2)中，浸泡时，乙醇和菌体的比例可为1mL：0.8-1.2g(如1mL：0.8-1.0g、1mL：1.0-1.2g、1mL：0.8g、1mL：1.0g或1mL：1.2g)。上述方法中，所述步骤(3)中，洗涤时，乙醇和沉淀的比例可为1mL：0.8-1.2g(如1mL：0.8-1.0g、1mL：1.0-1.2g、1mL：0.8g、1mL：1.0g或1mL：1.2g)。上述方法中，所述步骤(3)中，每次洗涤的方法可为：向沉淀中缓慢加入乙醇淋洗，搅拌均匀并抽滤。洗涤方法命名为乙醇淋洗脱水法，其不仅可以快速带出发酵菌体中大部分水，而且还可以带出发酵原料残余和醇溶性化学组分。乙醇淋洗之后菌体由明显的粘稠状变成可抓取的粉体状，主要是乙醇淋洗过程中带走了大部分的水溶性多糖、蛋白、发酵残余等物质，大幅度改善提取收率和晶体纯度。上述方法中，所述步骤(4)中，每次萃取的时间可为1-2h(如1-1.5h、1.5-2h、1h、1.5h或2h)。上述方法中，所述步骤(4)中，萃取时，乙酸乙酯和菌粉的比例为200mL：8-12g(如200mL：8-10g、200mL：10-12g、200mL：8g、200mL：10g或200mL：12g)。上述方法中，所述步骤(5)中，浓缩可为60℃以下(如40-50℃、50-60℃、40℃、50℃或60℃)真空减压浓缩。上述方法中，所述步骤(5)中，结晶时，浓缩后的有机相和乙醇的体积比可为1:3-5(如1:3-4、1:4-5、1:3、1:4或1:5)。上述任一所述的方法还可包括步骤(6)：完成步骤(5)后，将番茄红素晶体纯化3次以上。每次纯化方法可为：向番茄红素晶体中加入无水乙醇，溶解，之后0-4℃(如0-2℃、2-4℃、0℃、2℃或4℃)结晶。乙醇和番茄红素晶体的比例可为3-5mL：1g(如3-4mL：1g、4-5mL：1g、3mL：1g、4mL：1g或5mL：1g)。上述任一所述含有番茄红素的发酵液是由生产番茄红素的菌株发酵培养获得的。所述生产番茄红素的菌株具体可为重组大肠杆菌LYC029。上述任一所述含有番茄红素的发酵液具体可为重组大肠杆菌LYC029发酵液。重组大肠杆菌LYC029发酵液的制备方法可如下：从-80℃取出重组大肠杆菌LYC029菌种，在LB平板上划线，置于37℃培养箱中15h；挑取单菌落接种至含有120mLLB培养基的三角瓶中，37℃、250rpm培养至OD600nm为3.0-4.0，得到的菌液即为高密度发酵的种子液；将制备的种子液接种至5L发酵液，培养温度为37℃，pH为7.0、溶氧恒定在20％，与溶氧与搅拌和通气级联，通过仪器的智控系统调节转速和通气将溶解氧维持在20％；初始培养基中碳源耗尽后溶氧会突然升高，此时开启补料，通过DO-STAT法调整补料速率将溶氧维持在合适的范围；当菌体OD600nm长到90左右时加入0.1mMIPTG诱导；培养48h发酵结束。重组大肠杆菌LYC029已于2016年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.12883。上述制备方法和重组大肠杆菌LYC029记载于如下中国专利技术专利文献CN106434506A中。实验证明，采用本专利技术提供的方法从发酵液中分离提取番茄红素，纯度可达98％以上，收率可达75％以上。该方法提取的番茄红素含量高，杂质少，提取方法简单、快速、成本低、溶剂可以全部回收，符合工业化要求，适合大规模工业化生产。本专利技术具有重要的应用价值。附图说明图1为实施例2中获得的番茄红素丙酮溶液的液相色谱图。图2为实施例3中获得的番茄红素丙酮溶液的液相色谱图。图3为番茄红素重结晶的质谱检测结果。图4为番茄红素重结晶的核磁共振碳谱检测结果。图5为番茄红素重结晶的核磁共振氢谱检测结果。图6为全反式番茄红素的分子结构。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，重组大肠杆菌LYC029发酵液的制备方法如下：从-80℃取出重组大肠杆菌LYC029菌种，在LB平板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法，依次包括如下步骤：/n(1)取含有番茄红素的发酵液，收集菌体；/n(2)取步骤(1)得到的菌体，加入乙醇浸泡1-3h，收集沉淀；/n(3)用乙醇洗涤步骤(2)收集的沉淀2次以上，收集菌粉；/n(4)取步骤(3)得到的菌粉，用50-60℃乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯相，得到有机相；/n(5)将步骤(4)得到的有机相进行浓缩；然后加入乙醇，0-4℃结晶，得到番茄红素晶体。/n

【技术特征摘要】
1.一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法，依次包括如下步骤：
(1)取含有番茄红素的发酵液，收集菌体；
(2)取步骤(1)得到的菌体，加入乙醇浸泡1-3h，收集沉淀；
(3)用乙醇洗涤步骤(2)收集的沉淀2次以上，收集菌粉；
(4)取步骤(3)得到的菌粉，用50-60℃乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯相，得到有机相；
(5)将步骤(4)得到的有机相进行浓缩；然后加入乙醇，0-4℃结晶，得到番茄红素晶体。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，收集菌体的方式为离心或过滤。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，收集沉淀的方式为离心或过滤。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，浸泡时，乙醇和菌体的比例为1mL：0.8-1.2g。

【专利技术属性】
技术研发人员：付绍平，徐超，夏海容，唐金磊，张学礼，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12