一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的通用纳米疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的纳米疫苗及其制备方法和应用。所述细菌外膜囊泡含有分子胶水蛋白SpyCatcher和/或SnoopCatcher，所述肿瘤疫苗包括所述细菌外膜囊泡以及和所述细菌外膜囊泡以异肽键形式连接的抗原，所述抗原携带SpyTag和/或SnoopTag。本发明专利技术通过将含有分子胶水蛋白SpyCatcher和SnoopCatcher的细菌外膜囊泡作为肿瘤疫苗平台，与携带有SpyTag和/或SnoopTag的抗原进行连接即得到肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗可以有效激活机体产生固有免疫的同时，实现对多种抗原的特异性杀伤。依照此方法，可以快速获得针对不同来源肿瘤的个性化肿瘤疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的通用纳米疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及纳米药物
，尤其涉及一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的通用纳米疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来随着分子生物学和肿瘤免疫学的发展，肿瘤免疫治疗成为继手术、化疗、放疗和分子靶向治疗后最具潜力的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持免疫系统对肿瘤的识别监视，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，主要包括免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗、细胞治疗和细胞因子治疗等。近几年，肿瘤免疫治疗飞速发展，目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国FDA(FoodandDrugAdministration,FDA)批准临床应用，如免疫检查点抗体和CAR-T等。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。作为免疫治疗的一种，肿瘤疫苗是近年来的研究热点。根据功能不同，肿瘤疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性肿瘤疫苗，实际上是针对致癌性病毒的疫苗，如宫颈癌疫苗，能够有效预防HPV相关的宫颈疾病。本项目中的肿瘤疫苗主要是指治疗性疫苗：将肿瘤细胞内基因突变产生的新生抗原以多种形式，如细胞裂解物、抗原蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的DNA或者mRNA等，与免疫佐剂联合一起接种至患者体内，通过激活免疫系统对肿瘤抗原的识别、处理、和递呈，诱导机体产生对这些抗原的特异性免疫反应，从而达到控制或清除肿瘤的目的。2010年，首个肿瘤治疗性疫苗—，首个肿瘤治疗性疫苗抗原疫苗(Provenge)被美国FDA批准用于治疗前列腺癌。近十年来，伴随着二代测序、基因组学、大数据等领域的技术进步，人们对于肿瘤抗原的鉴定能力不断提高，为肿瘤疫苗的飞速发展奠定了基础。2017年，来自美国Dana-Farber癌症中心和德国美因茨大学的两个研究团队在个体化肿瘤疫苗领域取得重大突破，两个项目都是首先对肿瘤组织样本进行取样测序，并分别使用独特算法预测了最可能的肿瘤抗原，然后分别开发出了以多肽片段和mRNA为基础的肿瘤疫苗，在晚期黑色素瘤患者中展示出令人振奋的治疗效果。总之，肿瘤抗原的鉴定已经不是制约肿瘤疫苗发展的障碍，如何提高抗原的免疫原性，从而刺激机体产生强烈有效的抗肿瘤免疫应答，成为了肿瘤疫苗领域的新热点。借助于纳米技术，将抗原和佐剂与纳米载体偶联在一起共递送，利用DC细胞对颗粒物的天然摄取习性，提高免疫系统对抗原的摄取、处理和递呈能力，能够有效提高抗原的免疫原性。2016年，Moon等人设计了一种基于脂质双分子层的纳米盘疫苗载体，具有高效引流淋巴结的能力，被用于共同递送多种肿瘤抗原和佐剂，刺激产生了强烈的抗原特异性T细胞免疫应答和抗肿瘤效应。2017年，Chen等人将抗原和佐剂与EvansBlue(EB)连接，利用EB能够特异结合白蛋白，而白蛋白具有淋巴结引流的特性，实现了利用白蛋白作为“火车头”将抗原和佐剂共递送至淋巴结的目的。2018年，Mooney等人设计了一种PEI包被的介孔硅棒疫苗载体用于共同递送肿瘤抗原和佐剂，该载体能显著增强宿主DC细胞活化并激活T细胞免疫反应。2019年，Florindo等人开发了甘露糖修饰的PLGA纳米肿瘤疫苗载体，联合免疫检查点阻断剂α米肿瘤疫、免疫激活剂α免疫激活和MDSCs小分子抑制剂伊鲁替尼(Ibrutinib)对黑色素瘤的生长、转移、复发都具有显著的抑制作用。纵观近几年肿瘤疫苗载体设计，这些载体都需要复杂的合成过程和佐剂修饰，开发一种能够大批量快速获取同时本身具有佐剂效应的纳米疫苗载体，是肿瘤疫苗发展的迫切需求。近年来，基于天然生物膜的仿生纳米材料越来越受到研究者的关注。由于继承了天然生物膜表面的蛋白和完整的磷脂双分子层结构，这些仿生生物膜纳米材料具备了特殊的功能，如配体识别、生物靶向、长循环性等。其中，来源于细菌的细菌外膜囊泡(Outermembranevesicle,OMV)是一种特殊的天然纳米颗粒，由革兰氏阴性细菌分泌，粒径约30-200nm，是细菌新陈代谢过程的重要途径，能够通过细菌发酵大批量获取。由于革兰氏阴性菌的外膜含有大量的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，因此OMV具有天然的免疫佐剂功能，能够有效激活天然免疫；其纳米尺寸和外源身份，使DC细胞能够快速识别并大量摄取，提高了抗原的处理和递呈效率，增强机体对抗原的免疫应答能力。尽管OMV的免疫原性限制了其作为药物载体的应用，但是这种免疫激活能力使其成为理想的疫苗载体。目前已经有许多研究报道，OMV可以直接作为疫苗，引起机体对OMV来源细菌的特异性免疫，如基于OMV的B群脑膜炎球菌疫苗MeNZB使新西兰流脑的发生率和病死率得到了有效控制，这也说明了OMV体内应用的安全性和有效性。关于将OMV的免疫刺激功能用于肿瘤免疫治疗的研究还很少，目前只有一篇来自韩国课题组的报道，利用大肠杆菌来源的OMV刺激产生的天然免疫应答，能够明显抑制肿瘤生长，但是这一研究并没有涉及肿瘤抗原和特异性免疫。如何将OMV作为疫苗载体，在其表面展示肿瘤抗原，从而在OMV刺激天然免疫的基础上进一步实现肿瘤抗原递呈和特异性抗肿瘤免疫，是目前仍未解决的科学问题。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的通用纳米疫苗及其制备方法和应用。本专利技术通过在细菌外膜囊泡上表达分子胶水蛋白SpyCatcher和SnoopCatcher作为肿瘤疫苗平台，可以任意组装携带有相应标签的不同肿瘤类型的抗原得到纳米疫苗，可以在提高抗原的利用度的同时，还能显著刺激机体产生抗原特异免疫反应，增强对肿瘤的杀伤效果。第一方面，本专利技术提供一种细菌外膜囊泡，所述细菌外膜囊泡包含分子胶水蛋白SpyCatcher和/或SnoopCatcher。进一步地，所述分子胶水蛋白和所述细菌外膜囊泡上的细菌外膜蛋白融合表达于所述细菌外膜囊泡中；所述细菌外膜蛋白为ClyA、血红蛋白蛋白酶、细菌外膜蛋白A、细菌外膜蛋白C或细菌外膜蛋白F中的一种或多种，优选为ClyA。本专利技术进一步提供所述细菌外膜囊泡作为疫苗佐剂的应用。第二方面，本专利技术提供一种通用纳米疫苗，所述通用纳米疫苗包含所述细菌外膜囊泡，以及和所述细菌外膜囊泡以异肽键或共价键-异肽键形式连接的抗原，所述抗原携带SpyTag和/或SnoopTag。SpyTag和SnoopTag可以通过Tag和Catcher间的反应将抗原和细菌外膜囊泡连接在一起，该反应形成异肽键。进一步地，所述SpyTag包含如下氨基酸序列：缬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸，所述SnoopTag包含如下氨基酸序列：甘氨酸-赖氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-甘氨酸-酪氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡包含分子胶水蛋白SpyCatcher和/或SnoopCatcher。/n

【技术特征摘要】
1.一种细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡包含分子胶水蛋白SpyCatcher和/或SnoopCatcher。


2.根据权利要求1所述的细菌外膜囊泡，其特征在于，所述分子胶水蛋白和所述细菌外膜囊泡上的细菌外膜蛋白融合表达于所述细菌外膜囊泡中；
所述细菌外膜蛋白为ClyA、血红蛋白蛋白酶、细菌外膜蛋白A、细菌外膜蛋白C或细菌外膜蛋白F中的一种或多种，优选为ClyA。


3.权利要求1或2所述细菌外膜囊泡作为疫苗佐剂的应用。


4.一种通用纳米疫苗，其特征在于，所述通用纳米疫苗包含权利要求1或2所述细菌外膜囊泡，以及和所述细菌外膜囊泡以异肽键或共价键-异肽键形式连接的抗原，所述抗原携带SpyTag和/或SnoopTag。


5.根据权利要求4所述的通用纳米疫苗，其特征在于，所述SpyTag包含如下氨基酸序列：
缬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸，和/或，
所述SnoopTag包含如下氨基酸序列：
甘氨酸-赖氨酸-亮氨酸-甘氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂广军，赵潇，程科满，赵宇亮，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11