线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用及筛选方法，采用棕榈酸构建线粒体损伤模型；通过LC

【技术实现步骤摘要】
线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用及其筛选方法


[0001]本专利技术属于保健品或药品领域，具体涉及线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用及其筛选方法。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞的重要组成部分，一直以来线粒体都被认为是细胞内的能源工厂，负责为细胞提供必要能源，使其得以执行日常功能。而人体细胞所需的能量主要都是由线粒体提供的，值得注意的是但随着年龄的增长，线粒体功能每况愈下。然而越来越多的研究发现，线粒体不止"细胞能量站"的功能，它们参与了各种细胞功能调控，与许多人类疾病存在着莫大的联系，包括细胞信号传导、代谢、自噬、衰老和肿瘤发生都与线粒体的质量和活性相关。因此如何提升线粒体的功能和健康，被越来越多的研究人员所关注。
[0003]另外，尽管目前市面上存在大量宣称针对线粒体的营养补剂，但其中大多数补剂存在具体功效不明确，效果过分夸大，作用机制不清等问题。目前关于线粒体功能检测的相关技术种类繁多，且手段各异，较为通用的方法有相关基因蛋白检测技术，Seahorse线粒体代谢能力检测技术，透射扫描电镜观测技术以及相关代谢产物鉴定技术。但关于线粒体相关营养补剂的功能测定存在检测指标不统一，检测技术落后，检测手段单一以及检测不全面等问题。这些问题造成了市面上相关产品品质参差不齐，真假产品鱼龙混杂的现象。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术的首要目的在于提供线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用。/>[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种线粒体功能干预材料的筛选方法，相比较于现有的评价筛选体系，本专利技术提供的筛选方法更为科学、精准、高效。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现：本专利技术提供线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用，所述线粒体功能干预材料为烟酰胺单核苷酸（NMN）、海参肽、西兰花种子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或积雪草提取物中一种或几种的混合，优选为NMN或海参肽。
[0007]本专利技术采用棕榈酸（PA）构建线粒体损伤模型，研究发现NMN、海参肽、西兰花种子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或积雪草提取物都能显著逆转由PA造成的酰基肉碱的积累，特别是中长链酰基肉碱的含量，且对基础耗氧量、ATP 生成和最大耗氧量都有显著增加。PCR结果表明，NMN和海参肽处理后的C2C12细胞中，大部分线粒体相关基因发生显著变化，尤其是PPARD、Sirt3、OPA1、HSP60和CPT1b，mRNA表达呈现上百倍地升高。NMN和海参肽还能提高C2C12细胞中Cytc-1的蛋白水平，呼吸链复合体I也有增加的趋势。NMN和海参肽能降低由PA造成ROS过量以及MDA过表达，并激活SOD的表达，同时，NMN能显著增加NAD+/NAD的比例。由线粒体形态学分析图像显示，PA处理会导致部分线粒体发生肿胀，体积变大，内部的
嵴结构被破坏，使线粒体结构发生紊乱；而NMN和海参肽处理则能够逆转PA对线粒体的破坏，会使线粒体体积变小，数量变多，嵴结构恢复正常且清晰可见，线粒体形态趋于正常。
[0008]经上述研究表明，NMN、海参肽、西兰花种子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或积雪草提取物能够显著改善线粒体功能。本专利技术将有效量的NMN、海参肽、西兰花种子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或积雪草提取物作为活性成分加入药学上或保健食品学上可接受的载体，按照本领域常规方法制成药物、食品或营养补充剂等，用于治疗或预防与线粒体功能有关的病症。
[0009]本专利技术还提供了一种线粒体功能干预材料的筛选方法，包括如下步骤：（1）采用棕榈酸构建线粒体损伤模型；（2）通过 LC-MS/MS法测定酰基肉碱；（3）运用Seahorse细胞外通量分析仪检测呼吸功能；（4）定量PCR检测线粒体DNA含量；（5）实时定量PCR检测主要与线粒体相关基因的mRNA水平的表达；（6）采用Western blot法检测骨骼肌中线粒体相关基因与氧化磷酸化复合体蛋白质；（7）采用试剂盒检测MDA含量及NAD+/NADH含量；（8）采用透射电镜观察细胞线粒体的超微结构并进行形态学分析。
[0010]本专利技术通过采用棕榈酸（PA）构建粒体损伤模型，采用Seahorse线粒体实时代谢分析技术，酰基肉碱检测技术为主体，结合免疫印迹试验，实时定量PCR实验，试剂盒检测以及电镜观测技术，建立了一套完整的线粒体功能干预材料的初步筛选及功能评价系统，筛选出了具有干预线粒体功能的材料。
[0011]作为本专利技术进一步优选的技术方案，所述步骤（1）采用棕榈酸构建线粒体损伤模型具体包括如下步骤：a、 细胞培养选用C2C12成肌细胞，放入生长培养基中进行培养；b、细胞传代待细胞融合率达到80-85%时吸出生长培养基，用PBS冲洗细胞，加入胰酶消化细胞，当50~70%的细胞变亮变圆时，吸弃胰酶，加入生长培养基终止胰酶消化，脱落已消化的细胞，形成细胞悬液，离心，吸弃上清液，加入生长培养基，按特定的传代比例传至加有生长培养基的培养皿中进行培养；c、细胞分化待细胞生长融合率达到75-80%时吸出生长培养基，加入分化培养基进行分化；d、原料处理将分化好的C2C12成肌细胞中的分化培养基吸干，并用PBS润洗，然后加入棕榈酸溶液以及原料，将加好原料的细胞置于细胞培养箱中培养，然后吸取细胞培养液存放于-80℃，备用。
[0012]优选的，所述生长培养基含有10%FBS（胎牛血清）和1% P/S（双抗，100U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素）。
[0013]优选的，所述分化培养基含有2%HS（马血清）和1% P/S（双抗，100U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素）。
[0014]优选的，所述细胞培养的条件为37℃，5%CO2。
[0015]优选的，所述棕榈酸溶液的配置方法为：称取棕榈酸溶解于无水乙醇中，得到棕榈酸乙醇溶液；称取BSA溶解于PBS中，得到PBS溶液；将棕榈酸乙醇溶液加到PBS溶液中，配制成终浓度为5 mM的棕榈酸溶液。
[0016]大量研究结果表明，衰老的发展过程与线粒体功能异常有密切关系。在衰老过程中，线粒体生物学发生变化，线粒体产生自由基和自由基对线粒体的损伤对衰老的发展起到促进作用；线粒体 DNA 突变和线粒体对细胞死亡进程的调控与衰老的进程有密切关系。
[0017]根据本专利技术筛选方法，研究得到NMN、海参肽、西兰花种子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或积雪草提取物可显著改善线粒体功能，进而具有抗衰老作用，可应用于抗衰老食品、保健食品、药品等领域。
[0018]本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：本专利技术提供了线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用。结果表明，线粒体功能干预材料能显著改善酰基肉碱的积累，且对基础耗氧量、ATP 生成和最大耗氧量等都有显著增加，可应用于保健食品、药品等领域。
[0019]本专利技术提供的线粒体功能干预材料本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.线粒体功能干预材料在制备改善线粒体功能的保健品或药品中的应用，其特征在于，所述线粒体功能干预材料为NMN、海参肽、西兰花种子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或积雪草提取物中一种或几种的混合，优选为NMN或海参肽。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善线粒体功能是改善酰基肉碱的累积。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善线粒体功能是改善基础耗氧量、ATP 生成或最大耗氧量。4.一种线粒体功能干预材料的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）采用棕榈酸构建线粒体损伤模型；（2）通过 LC-MS/MS法测定酰基肉碱；（3）运用Seahorse细胞外通量分析仪检测呼吸功能；（4）定量PCR检测线粒体DNA含量；（5）实时定量PCR检测主要与线粒体相关基因的mRNA水平的表达；（6）采用Western blot法检测骨骼肌中线粒体相关基因与氧化磷酸化复合体蛋白质；（7）采用试剂盒检测MDA含量及NAD+/NADH含量；（8）采用透射电镜观察细胞线粒体的超微结构并进行形态学分析。5.根据权利要求4所述的一种线粒体功能干预材料的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）采用棕榈酸构建线粒体损伤模型具体包括如下步骤：a、 细胞培养选用C2C12成肌细胞，放入生长培养基中进...

【专利技术属性】
技术研发人员：李言，王立，聂陈志鹏，贺瑞坤，张旭光，
申请(专利权)人：汤臣倍健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：